CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

随时准备下线

当检测不出来的时候，可能原因有俩：3 Z+ U; O) v" l6 y  r! b' x4 q
1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；
" n/ `, }  L8 ], e2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。* N! s$ i! y: T

luoye1986

haosenna，给你顶一下

随时准备下线

回复 随时准备下线 的帖子& q! ]3 m% ~/ Z: h) m  M
' v; A, c& L3 h7 r
补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

回复 luoye1986 的帖子. S% K; G2 ]; C3 \
) |8 ]1 {6 H5 D% ?/ m" S) L
你是谁！！！

ET生物人

回复 随时准备下线 的帖子2 v9 p$ _' U  b# K8 }/ c
4 r8 U* ^) f  F6 a; E
一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

随时准备下线

回复 ET生物人 的帖子
* Q) _* \2 r: ]; E& R" N
, F. d( Z7 u& H; k弱弱的问下：5 t0 h% y/ i& |! t' q% X( R
1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？4 J7 c0 @4 }; s. t# t7 e6 M3 B4 ?
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
: ~- j9 S; y6 ^( Y0 u3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

随时准备下线

我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

回复 随时准备下线 的帖子
" E0 |' t9 ?1 O0 D$ {! L8 k' k" g; q  s" q
额。。
, i* g! _0 I: J3 H4 T$ u1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取3 t' S6 U- W: x) x5 L1 N
2、细胞打孔标记检测没听过这个方法
0 p5 G2 g; p; ], q2 h! o: f8 f% S0 o3、我们设计的是Fab抗体 间标的

随时准备下线

6 D4 I$ w: z6 U: R& \
3 ?3 W6 b4 ?6 V4 Q- H回复 ET生物人 的帖子( d. V) d0 @( G% F1 ?  y! z  {

  ~$ Y3 `# j8 ~2 {+ u% F' x间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。
0 [: g7 T# \! L9 x- ^0 o+ u你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。
: K6 D7 k) k3 S" f( e5 w这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。