CAR-T的相关检测

ET生物人

各位大神们，感染完CAR的T细胞后，流式检测检不出CAR的抗体蛋白，但是做QPCR确又能检测出CAR的基因！跪求各位老师解答一下，这是什么的情况？

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当检测不出来的时候，可能原因有俩：
9 k4 M% |* P2 f3 @4 T6 w; H4 H1、使用的抗体和你设计的CAR胞外结构无法特异性结合或者特异性太低，这个可以通过阴性对照看出来；
9 P* H! s$ X. j  c2 f+ p. H% K2、你应该在做下WB，确认下你的CAR分子表达是细胞膜表达，还是胞内表达。
+ |+ T8 [. j5 ]0 z

luoye1986

haosenna，给你顶一下

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, c% B- d; w& i3 q2 C
; `- T! P- j; M. K# a- M. |3 i- d补充下：如果是膜表达的话，阴性对照如果也测不到就是说明抗体有问题，针对性不强。可考虑采用间标的方式试一试，不然就只能重新设计膜外的ScFV，或者换抗体了。

ET生物人

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6 m- t. K5 |( l. V7 E3 B% N6 x
你是谁！！！

ET生物人

回复 随时准备下线 的帖子4 B& w: J# B5 V& g- q; g( `& ?

% [4 R8 p' Z3 s! a, X  Y一直有做，应该不是抗体的问题！！WB也不能检测蛋白是否表达胞膜或膜内吧！！只能表达蛋白是否存在

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2 D7 V* a* w# |( C5 V) u9 E1 \* n/ s2 }- D7 A
弱弱的问下：
9 w# r+ m0 S/ Z. o& h$ O1、分别提取细胞膜蛋白和核蛋白，做WB，不能确定其是否为膜表达？2 a. _1 }% h5 z- C' b
2、如果你确定抗体和你的设计都没问题，流式检测为什么不试试细胞打孔标记检测？如果胞内表达，这应该可以测出来。
2 g! t/ e- }7 q9 Y8 ^% H3、我想问下，CAR分子设计的胞外部分，抗体针对的是哪一部分？跨膜区？Linker？现成的抗体都针对的特定区域的特定部分，这里设计真的很重要。

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我看几个大牛做的CART检测抗体很多都是自己实验室制备的，而不是直接买的，这是否也可以说明一点问题？

ET生物人

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) Y; |0 h1 O; h8 o额。。" E* E8 L% b! B) {( D# U, d$ M
1、没想到膜蛋白跟核蛋白分开提取
# x  O+ w! ~5 a- y9 w  ?2、细胞打孔标记检测没听过这个方法' L+ n! N) \% P( y1 _9 w5 w; s
3、我们设计的是Fab抗体 间标的

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; B. `* Z, ?6 T3 e9 @1 |2 J  o- g* b, N  y# X1 A  t
间标检测的话，特异性必须好，同型对照很重要，关于打孔检测，已经算常规方法了。比如测Treg的FoxP3一般都需要打孔。( s1 q! M' B9 v' Y& N$ \
你还可以尝试做做免疫荧光染色，看看细胞表达情况怎么样。表达丰度是否合适，太低的话，可能对流式检测也不利。
, J: [; w' Y2 s$ Z这对载体和不同种类启动子等要求都比较高。所以设计的时候都必须检测，选择合适启动子和载体。