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本帖最后由 泡沫清风 于 2009-8-20 12:20 编辑
/ h- m n' k& _5 B0 @7 y+ U% b" n) K" N
铺皿后19小时左右，观察细胞密度：
0 c7 ^6 N9 P! }3 S' _" d) P7 T3 h1 `4 b; V6 W9 d
4 U. ~4 h6 N1 N2 ^( v实验准备：
5 {& R; s( Q' T& i! D1、培养基：DMEM+10%FBS: i( m5 Y8 s8 |" J
2、lipofectamine 2000 （invitrogen）: y! d; |6 ]3 r- Q2 U
3、OPTI-MEM （GIBCO）
' F& K& Y, _3 z) h a) `: h( P8 b4、质粒
4 p$ X7 ]( M# G, ~ C. R 两个目的质粒：MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP. O8 P4 G$ C! s. @6 `' R) u
MSCV-IRES-GFP0 z% a6 Z& R9 ?5 ^" y; e0 k6 P: ~: p
两个包装载体：pKat和pCMV-VSVG& g* [$ x* e6 N. S
& D! h, B% E8 @3 X- M9 Y实验步骤：( y$ d T* ^* E
1、弃去6个皿中旧培养基，各加入4ml新鲜培养基。9 e) {5 ]9 [9 W
2、制备质粒-lipo 2000混合液：* t% ^7 ?1 Z+ o3 [5 x
（一个10cm皿我用质粒的量是10ug，lipo2000的量是20ul，OPTI-MEM 1ml，6个皿中其中4个皿用来转染MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP，另外两个皿用来转染MSCV-IRES-GFP作为对照）( f% J. M5 g$ L
. X1 B7 T, V2 z& Z5 M; }& X/ f （a）取一个4mlEP，加入120ul lipo2000，再加入3ml OPTI-MEM，混匀，室温静止5min。（6个皿的量）5 j4 c. Z8 g; l! I
（b）取第二个4ml EP，加入MSCV-IRES-GFP 10ug，Kat和VSVG各5ug，加入1ml OPTI-MEM。（2个皿的量）
0 |+ t: V3 d. O8 o& y3 r （c）取第三个4ml EP，加入MSCV-BCR/ABL-IRES-GFP 20ug，Kat和VSVG各10ug，再加入2ml OPTI-MEM。 （4个皿的量）& _% ?) h; ^( O+ u5 E" |0 D
（d）取（a）中1ml于（b），其余2ml到（c），混匀，室温静止20min
2 r( l C# D1 P- r1 m3、在1-4皿中加入（a）与（c）的混合液各1ml，5-6皿加入（a）与（b）的混合液各1ml，注意一滴一滴加入。这样每个皿都为5ml总体积。0 \! M. n0 ? s2 Q2 d2 ?
4、放入温箱培养，到6小时时换液。 |
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