如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR5 v2 a+ X; b' K5 H
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈' ^) W0 F1 }! E
但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

2 P$ b1 N3 R, Y/ c$ S  p
# l$ W7 P  k8 w9 Y选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；( _  [1 a  n3 ^9 H/ G
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
5 b, ?4 [" E5 |* Q' i- v. {. h如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
: U& o& u! x0 D# J1 j最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
( C7 V5 `7 ?9 w- E- C; }  |# ^本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger 4 U/ I; @/ p2 x" x0 R* W; J
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：7 v* w7 G1 z- C+ A# m% f* R  c5 S
首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；( f0 m1 M; Y& M# v) w! G4 f( J  ^
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；4 l2 g1 p4 H+ o& P7 j' I
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
. q; a7 Y2 U0 B, c+ n: \普通 PCR反应：
+ g3 D9 R& ~. l7 DTaq DNA Polymerase 5 x% S; ]: G$ r
rTth DNA Polymerase
% \) ~6 w5 z6 q( w/ D# I" I* l高效率 PCR反应：1 v9 f+ O* B  r* F9 Y
Blend Taq
0 p7 g, u4 Q4 g, q- r# `# i. QBlend Taq Taq-Plus Plus-
1 d7 H9 l7 R2 S. aKOD Dash (LDP LDP-101)
4 h2 u' T0 Q* o( ]KOD KOD-Plus Plus-
! N6 X( ?4 A; v9 GKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
: [9 V: X  v4 \: {$ f4 z6 jKOD FX * s7 i) ~5 z1 F7 X8 F
高保真 PCR反应：
3 p9 i/ K* i* t' N6 T9 QKOD DNA Polymerase2 C! r- e3 x' R) ^  ?
KOD KOD-Plus Plus-
9 H7 z/ w0 Y& n0 c( c) Z( W- aKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
' l, G( |. m( w& v3 Q) T+ tKOD FX
( D5 H9 P$ o" ]长片段 PCR反应：
% W. d% F9 ]# r3 ?# u: H0 O: V4 @2 `Blend Taq Taq! A# i% Q, \" f& d5 Z- e8 H
Blend Taq Taq-Plus Plus-
' t( n# j0 `. _- K- c8 L" `: x9 k& EKOD Dash
5 G- t# {. P* s. t2 H! N. iKOD FX

exin11

学习了