如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR$ |9 Z& F: l) |" J; Y
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈8 O5 q8 ]6 k3 N( Q; G$ E
但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

, p# n% o" |( y, \6 [
, n2 E( V- S  @) e# o" [/ _' ]
选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；" \# R: \+ D5 S" T
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
! \  I. x  X, {; [: d4 ~如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
& R/ [0 I# P0 H5 M5 H7 ~* E最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
& I: O" ^' n  i  d本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger : J, `$ O2 w7 _9 g
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
, H8 \$ ?1 Z, h$ t1 t% b首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；! Z' z% v5 G4 D2 d
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
( G9 j$ Y2 }1 J7 {) p8 P第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
9 Y# G  i% ]# `, h. ~普通 PCR反应：
) S# q5 i9 o; q- G. ETaq DNA Polymerase ; `; a$ H" A% o
rTth DNA Polymerase * v$ `3 V, [' O7 z7 I& Q
高效率 PCR反应：
0 y) l/ @4 [- V9 A* SBlend Taq 0 Y0 d5 B, L" ?! g, B) K$ V
Blend Taq Taq-Plus Plus- ( L2 ?1 v) j! H' j1 z
KOD Dash (LDP LDP-101)
3 {* ~! M1 L0 o1 kKOD KOD-Plus Plus-
7 j( P* L& B: o+ T! G) vKOD KOD-Plus Plus-Ver.2
8 t; i+ b* g+ r1 V! \KOD FX
& P# _8 k1 T: O/ ]9 O- {高保真 PCR反应：
5 G+ i9 E3 @3 l( K( _KOD DNA Polymerase  K& u3 z* l1 d4 J+ Y6 d( r  h0 P
KOD KOD-Plus Plus- ' o4 {' v9 C+ T; @; C0 Z# h/ q: ?
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
, R  G! T' W+ Z$ L( x9 _9 _KOD FX # g2 ?) ^! _' B
长片段 PCR反应：
; J# _; N) O2 PBlend Taq Taq/ Y* m, z9 t1 ~" X
Blend Taq Taq-Plus Plus-9 g  n" k8 o1 Z" N6 k7 T! b
KOD Dash
; h0 M2 X' w7 x# P  u7 eKOD FX

exin11

学习了