如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR2 _- w8 @/ M+ j; L9 h* E0 J: Z# t
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈! f) m! v4 W# Y8 N% M
但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

. j1 c: ~/ V8 j3 p* O! n" t8 h( {- U. W0 O" z9 ~! ?
选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；% b0 y4 A' t6 e2 ?
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；! v2 S6 t  P1 g1 f9 s# L
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。" u. \) k* @8 M4 `7 |
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
0 p- T' N% W7 x  u8 b) |# V5 z2 a本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger
# v  W6 M9 J  H2 `另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
, V8 s3 i6 c  d5 |& F( l* W首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；5 D9 _2 }0 {. a
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
' s$ h1 @2 ]+ ?8 l* Z2 x. {3 M, M第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。6 A4 \3 G6 U7 n, o
普通 PCR反应：( H) |) j* r1 j
Taq DNA Polymerase
5 h& g* X: Q6 lrTth DNA Polymerase
1 C' ]8 N% ~* [! v2 l高效率 PCR反应：
0 B8 m- T7 v8 E; B7 x# X8 gBlend Taq
& P3 b6 W) l/ d; N' o' U$ {Blend Taq Taq-Plus Plus-
( ]. X  N1 S8 B; h1 sKOD Dash (LDP LDP-101)
0 _- Y# Y( A0 U( KKOD KOD-Plus Plus-
3 m5 j. \- v. ?, @1 H6 vKOD KOD-Plus Plus-Ver.2 0 y/ _9 J, S  V: Q7 S- J. r: w
KOD FX ; n9 J1 P0 O7 z  A) o' t2 P" m6 k
高保真 PCR反应：) d1 V9 g% _6 {0 O3 g* o
KOD DNA Polymerase3 o* u3 I# l5 ?4 s8 h; `
KOD KOD-Plus Plus-
; v7 c+ E5 w& f* K/ E  p2 fKOD KOD-Plus Plus-Ver.2 ! M  S9 ?" ^5 j( w; p
KOD FX
0 f" ~( X+ g5 ~7 y% ~7 g* ~长片段 PCR反应：
( w  i5 O. ?6 J% E3 VBlend Taq Taq: a3 ^' H$ X" b! p  a
Blend Taq Taq-Plus Plus-
' A7 Q$ p- h; Y, {0 EKOD Dash ) L) S; Y, f& ~" b
KOD FX

exin11

学习了