如何用PCR扩增长的片段

julia20

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) v4 i- p( _! Y2 c. N* j6 I
% \; ?6 X8 H0 ^7 Z7 E2 K7 R* S% Q长片断是在基因组或者是逆转录文库里面是什么意思? 这些不好做, 那在其他什么情况好做呢? 谢谢!

chenhuachen

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0 m7 ^5 \; e+ m- L' e! [7 U& o& [4 v( U' m
你好，想问一下第三条中“逆转录文库”指的是不是cDNA？

exin11

学习了

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
9 l/ ^! D6 Q) A  c普通 PCR反应：6 j  }3 K5 B7 l0 X8 M
Taq DNA Polymerase 9 }% W& r7 _& b7 E% L  r
rTth DNA Polymerase 6 I  y3 m( ]8 o4 B0 `
高效率 PCR反应：
) W* \* X# v2 W! LBlend Taq
! n1 |) ?! ]. w/ V" L& ~Blend Taq Taq-Plus Plus-
# H# k! G- A6 o3 g0 K$ V. W( PKOD Dash (LDP LDP-101)
5 n: g7 {  l4 P2 yKOD KOD-Plus Plus-
. Q( U( C2 p+ B* k9 xKOD KOD-Plus Plus-Ver.2 & e+ H: o4 O( K; U& S
KOD FX
/ D% X: G. Q. H8 @高保真 PCR反应：
$ Y* R+ B0 W) v% dKOD DNA Polymerase
! N- y# ]. X& I: b9 AKOD KOD-Plus Plus-   w2 P( T$ x) N5 O' j8 c
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 * ]+ |$ X7 E7 P
KOD FX 4 X  Z' o* G7 A+ L* f
长片段 PCR反应：. ~$ K" u" f: {0 ^( l# A+ }
Blend Taq Taq
/ d( p& A* @0 h6 A- B" W0 [9 V0 MBlend Taq Taq-Plus Plus-+ C+ S$ ~9 E; I4 y4 b3 E
KOD Dash + o. P% Y$ I0 u& |0 N
KOD FX

weiyepan

回复 3# hawkyiger 1 k8 X4 E1 V+ [+ ^3 A7 x
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
( Y5 r6 Y, H0 z2 L: O& c2 Y首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；# K- |+ A' R* T  v9 [) n
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
% }' A: W4 X! W/ Q& m3 j9 a3 B第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；2 e' z9 \/ p$ @& m# {
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；
2 }$ C# U; h% g8 M如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。
/ E( B6 F+ M# ~) z最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！
9 N2 W% l* ]0 M1 B2 V0 h本人PCR牛人，大家交流哈。

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

shihuijunm

7 J5 y) C8 C2 r5 k* f, A
1 n# j  j9 A6 E0 {
选好的PCR酶，保真性高的,

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
' Q  L# \" l( ?但是实验的时间和工作量都比较大

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。