如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR9 h6 H) g) }. @9 c% a
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
2 C# ]1 J* O, p, _4 j: q0 c: F但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

4 g* x' y. U! j0 |/ H) Q

8 j6 w* K$ u. Y, f选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；3 n3 f  e) R. @& R
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；" N5 Y3 }7 q$ x+ B0 x6 H
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。! v- D7 h, N* |2 [7 p! R
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！: W. G- @/ }2 r; R% T% C
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger # ]0 T+ a# x5 C& j1 x- N
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
' l- b9 T. c' e1 h首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；/ t- R/ u+ [7 P& U* `
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
- m$ i5 M7 _: P5 d第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
# C9 N2 @9 `: L7 z( l' A普通 PCR反应：( g2 C5 p- _9 y! {% J
Taq DNA Polymerase ! `0 {- f/ E/ w" h* S! ^
rTth DNA Polymerase 8 S* V0 S! z5 i% ^9 I4 q
高效率 PCR反应：( h1 [* c6 d% N9 @$ j; O+ A
Blend Taq * ~- d% H- g. u) T# r0 K
Blend Taq Taq-Plus Plus-
- B7 u( M5 v4 B2 P$ t% JKOD Dash (LDP LDP-101)1 c! \) u/ q- H
KOD KOD-Plus Plus- 2 H0 p" a) K# a, D4 T+ H
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
* F$ b6 V# b3 H$ a/ g; xKOD FX
6 F2 z6 B5 w0 ?$ n高保真 PCR反应：' B- H0 u! Y- E! a  d; J
KOD DNA Polymerase
$ V1 Y  ]; I" F3 n8 U+ kKOD KOD-Plus Plus- 3 E7 h+ X7 S9 K  L6 f# T
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 ) V9 A7 q- `& i& |. N* k
KOD FX
. q) m) a" @+ O, B, h! R5 H长片段 PCR反应：
; Q9 p( B# m1 g. k6 c7 qBlend Taq Taq. U8 [$ T$ y# O( W: x# s+ [
Blend Taq Taq-Plus Plus-
, E9 i* n( u  g% i8 _( S/ @9 vKOD Dash # b% X6 U# W' Z" E& H1 O5 i4 e
KOD FX

exin11

学习了