如何将胚胎干细胞和支持他生长的饲养层分离开来？

mominglily

对胚胎干细胞做毒性测试，怎样将胚胎干细胞和支持他的饲养层细胞分开，以使加到96孔板中的细胞是纯粹的胚胎干细胞而不夹杂较多的饲养层细胞？
8 I2 n8 ]& M0 ~1 C- [请教各位，谢谢！

待鹤

使用MEF来源的条件培养基代替feeder。) j$ Z/ d' f4 C- b/ Q
条件培养基制作方法如下：1 p* l3 E+ B3 W5 `$ [; K& H; [
Preparation of MEF- Conditioned Medium (MEF-CM)0 {! f( {" u- r) h
1. Plate 4 x 106 mitomycin C treated MEFs in a T75 Flask coated with 0.5% gelatin, in complete MEF medium.9 A5 K$ ]# z7 l# a
2. The following day, replace the MEF medium with 37.5 ml 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF, and incubate for 24 hrs at 37°C, 5% CO2.
3 e$ F# \  w1 k* ~0 F% v3. Collect MEF-CM from the flasks after 24 hrs and 0.22 μM filter sterilize. MEF-CM can be used fresh or can be frozen.& U+ X" a5 V2 k/ E% K
4. Add fresh 20% KSR hESC medium containing 4 ng/ml bFGF to the flasks.
- F/ |$ _0 \, L0 V( M0 E5. Collect MEF-CM for up to seven days using this procedure.
2 t' V" W8 a$ x1 X! t4 t6. Depletion of L-Glutamine and bFGF from the MEF-CM is assumed, and L-Glutamine (to 2 mM final), and bFGF (to 4 ng/ml final) are therefore added back prior to using MEF-CM with hESCs. Freshly thawed ß-Mercaptoethanol (ß-Me) is added to 0.1 mM final fresh each day of use.

待鹤

这儿还有Nature上的一篇protocol。
/ j; Z, V5 z' _* J) ]Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.pdf
) u5 K5 J" {0 _7 a- W' S/ j

mominglily

万分感谢，我先下载来学习下，但是目前我们在做的是含有饲养层的mES细胞，就想寻找针对有饲养层细胞的方法。

czzhaozhu

对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。

mominglily

回复 5# czzhaozhu
- k; a0 w$ |* c8 t6 S$ y, }& r& |3 m( A, j0 t; q, N9 g, U
  x/ B' \0 a/ a* X! S. l/ W) e
    谢谢您！我自己也打算用这种方法来做，但是是否必须选用和原板面积一样大的板来爬呢？用较小一点的面积的板可以吗？！~还有就是爬的时候需要加凝胶铺板还是空板？因为有人说使用空板来爬，谢谢！~

冰罗布

谢谢，学习了

blue11sea

应该使用空板来爬，因为有明胶ES也容易贴

blue11sea

MEF贴壁速度和明胶关系不大吧

可怜的孩子

“对于mES细胞和MEF feeder如何分开来，我们实验室一般采用差速贴壁的方法，MEF feeder1h左右在明胶包被的皿上有70-80%贴壁，而ES细胞基本不贴。”: p4 R: {( z  O: d5 s2 I  i

: x7 P) W0 }4 Q丝裂霉素处理过的MEF吗？