MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。
9 ~% l2 ^" R$ T+ D! I* L3 k
% M) H+ e& A/ G4 \5 l! r" \8 b. k免疫细胞荧光化学技术的步骤:
7 F& B5 R3 x6 k( m. S) b* @3 r3 d. ^2 U: Q  x1 ~/ Q3 |
   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。
0 y; B% r- e+ |" `7 R ; j3 S3 R+ z9 C6 h3 ?
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
, p8 f. i9 [$ @7 x, N7 wPBS洗3次 ，5min/次.
1 f& Q7 @3 d3 D4 g6 \# v/ n2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
1 u8 ]0 U1 z+ t" ?洗3次，5min/次.
# K$ P( h8 A0 n% A* N) v$ D3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。( r& \' G$ J8 z: k4 ]) Y
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.
9 k. w; f, H, s$ C' ^9 W7 U0 Y3 W7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，8 A1 t/ M4 s' w9 V8 w9 L% B
5min/次.
) [2 C0 g. R8 R  y5 X8 ~* V8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。5 G" e: [+ z+ ^  p5 G
7 q7 g2 h3 ?# Y( o2 t
这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：
/ b' `( {7 X# S( N* B1 u固定，3.5%PFA，30min
5 S" T) B( w* q# @6 g0 ~1 W$ g透膜，15min RT
: U  O  W* ^9 H2 v) Y2 U2 V; C封闭，1%BSA 1h RT dark
7 d" q; ~* z6 m* l加抗体之前我都洗了的
1 N6 t" m% M- \/ M; l过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。, t! T1 L" x5 `4 ~5 J+ }
最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng 7 |+ I& M6 W5 o5 O! i
/ I. w9 E$ h5 |- A
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：4 j' r5 e  ?0 K1 p
1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？
4 Z( w) _% {: n/ I6 e5 f/ t2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？; t3 Z5 y* t1 ~0 u2 e/ L& ~
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？
( O; j5 @. ?# `9 W+ S7 F4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey
$ n9 H) ]* O6 ^$ u, ]+ d/ E$ i+ y" C9 V  o5 _* R1 b5 B8 X

2 M! o$ r8 Y: h: O# u; @% A3 f    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？
. [6 n5 x* e1 h# W2 Z4 n5 U' C' p
0 h3 D! G5 M5 z- L6 e7 b) h: z我一直被告知不能看.....汗