MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。; Q; \5 `+ i1 Y% x  O* M, ^  ]) j

- [0 ]6 u. b: j$ [( A9 U免疫细胞荧光化学技术的步骤:2 ~/ D4 T* L% a
; ?: {6 {; |0 J
   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。
$ F5 {  F9 }0 Z " H! p. ~0 ^* |$ n$ w
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。& K9 C3 y. y/ B
PBS洗3次 ，5min/次.* \* b5 R/ R8 F7 g8 g% ^
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
6 e# c/ J" A. a" d- r" U1 ~5 \洗3次，5min/次.3 h& W3 f0 \+ }; n4 f3 U8 J
3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。, @0 s0 T/ b) u: U% t8 k% q3 X
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.6 ?- R8 z# O# Y0 r1 S; k2 o2 z$ F2 }
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
3 ?% }: h4 t% y, W) B' }7 y' D5min/次.
0 S; T4 p* {+ ~% T. U( M8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。
& J5 o5 q0 B  S
! B& H$ v( F( P9 p2 N. H; o3 Y这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：  }8 a9 S5 n& c' f
固定，3.5%PFA，30min
2 T% W5 M- \( j' R透膜，15min RT7 W& o9 T9 Y4 p* ?, k: c
封闭，1%BSA 1h RT dark
/ O" l( z4 Y% Y4 d# i加抗体之前我都洗了的
  s4 c5 X% ^8 ^# m1 V过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
6 [  c8 p9 C4 _$ z最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
! b% H' b" `: B6 s3 D% ]0 ~* V7 s8 C' j+ d+ l9 S) A) S3 X) [
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：, C5 q! b# ^. p! U$ q- d
1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？
5 n) s# _( r$ V% Q  F8 B( m; o2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？/ f# ~* w6 ~8 y& g) m( p
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？
) e) b7 W) |& \. _0 g- s8 E4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey
# K: t! z3 e- C. b: L5 ~
2 K! v+ V3 H# W2 H. ^; \5 f/ U4 A
    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？. o" L; \) B7 F6 d
+ r6 R3 o7 W8 c% D
我一直被告知不能看.....汗