求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？- H' h' ^9 {$ T; X, `6 j
大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：
2 \: w* [, V, v3 @  D& A
2 U. ^$ h) v' B  |9 ^肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
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5 L2 u: ?$ k0 Q0 B% R; G' s! Z1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min
5 }" Z* C# l- S" R0 j2 y2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球- K/ p% x+ s7 W# O8 `% G
3. 离心后弃掉PBS& I6 `0 p5 G' d; z( Y9 p& {% E4 a4 \
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。! z! g+ o8 K- f
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散. k% m. ?9 o0 H6 [- j& o
6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。
" l, {$ ?0 ^7 h. U. S1 V2 B2 {
# _0 z: V0 W' e. e. L这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。) l2 @0 W. r# I; V6 D9 i! W( E
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我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
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你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子0 G* P3 N  ^0 j* {8 I! i+ [' }

+ v- ^/ S2 u4 [非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子
8 `5 Y' d, G9 O9 y7 p3 e$ J3 y5 E! r1 Y7 Q: X! K- }- E0 t% d6 `
想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子, e5 ]; E0 Z# K2 A7 i. D
6 [, \2 K% F! U
to cookiezhang：' C  l0 R* L! Q6 p0 _* e, m
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    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子# F2 z% k, w- B6 v2 C6 _2 C3 f
. }" X+ h: v) `7 O# b  H
请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
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; N5 f9 T! I! p1 @/ N( d0 Q& l7 T, d. X. i
# }% v( W0 x/ G) m
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
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而判断的标准一般需要从你读文献中获得。
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! ~; W) P5 v. I& c% b/ s9 \2 G4 t比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？1 i( S3 b' r9 f( _6 F. W
1 N, e9 P* [2 A2 l, Q  B# R/ }
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。
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9 d$ t- u8 o" _8 _# |只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。& a  e1 [' v$ J0 {9 S# r

9 O. X0 j8 ~1 ]5 x$ P: j1 {( c个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子% ^. X' w' \% i0 U; U

3 }8 d) |" Q7 s+ l; e) d- {恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ e0 [6 {) i% J3 R4 W1 k, E

+ k+ M$ h7 E6 V! D你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。. e6 R% \# d% {; M

7 J; ~, L' p- k+ ?7 L, ]                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。; A6 C' W( d, ~2 Z" j
* I" \% U) h; h. n2 \
                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。1 J3 b& C  O7 C; k! M' d
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                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。
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                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：" l+ P% h0 N& D6 f

7 r# R: Q8 N+ {: O$ S1 {0 w                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
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                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。2 p( @0 W9 I3 m" s$ y

7 ^% ]% x6 d- n0 a                3. 多加一些培养基。
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* |8 c1 L9 s2 t2 x3 i: e! L% V& p6 H               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。1 \+ ?# k" t, v% w; x; s& K

0 C8 a; d( U$ _7 m* `. \               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
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! f, b5 [/ w7 L               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
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5 F0 `9 f$ }( @' k       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  0 o. {. m1 m) C' Z* o
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       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。