双酶切连接的一些问题

sidalin301

最近在做双酶切连接，总是问题重重，请有经验的指导一二，多谢了！
* x5 P# a" ]- R) B' V6 R% h- R: y4 R7 r3 s2 o) ~
问题1：为什么转化、涂板、菌落PCR后除了目的条带（900多bp）外，还有很亮的300多bp的条带？) D' ^- C' A# n7 t8 e" @9 o9 M0 s
问题2：转化菌涂板后放37度时间长了些，怎么每个较大的菌落周围都有很多微小的菌落？导致我后面挑克隆很难，也许挑的不纯，影响了菌落PCR的结果，怎么会有微小的菌落呢？这些菌落里面有没有目的片段？; O9 l7 `9 H! Q

6 P, W& J+ d- @$ M4 T! Y. g' M6 f7 l2 W. k
说明1：载体质粒（改造后的PNL）双酶切（Nhe1、BamH1）后进行胶回收，只有2条带，除了双酶切位点之间的300多bp的条带外就是一条10kb左右的质粒条带，" t! v  |4 I  E$ z/ Z; E& Z0 i' l
说明2：我用的是fermentas的连接酶5u/ul，说明书上说粘端连接时酶量为1u，就是只加0.2ul，我感觉不好取，所以就加了1ul进去，不知道这个会不会有影响？
( X/ @& m9 z+ K

ghfvcat

回复 sidalin301 的帖子
5 x0 ]5 m- w5 W7 t
2 C& G* p+ [) r2 ^/ A1：PCR有杂带不用管，你拿质粒去测序，对了就可以了7 C4 T6 m1 T! f" w
2：时间长了点是多长？24H？有几个可能的原因，一是抗生素有问题，或者是浓度或者是质量，所以导致没有抗性的克隆也可以慢慢长大，或者感受态有污染之类的，二是长的时间太长了，长出来的卫星菌落？
) v# d* J4 y  x3 S) v- _  v. Z* Y连接酶加1UL肯定没有问题

siyue13

问题是你好浪费呀，本来可以多用几次的

张也行

PCR有阴性对照吗？是不是污染了之类的？% s& `( j- ]3 K: p& b" R2 D
在细菌培养基上培养时间太长就容易在周围长卫星菌落，所以要及时挑菌，中间有抗性的菌把周围的抗性抵消了吧。
- t* w, P3 W# K3 v% W  p" L( A酶的量用多了应该没有关系吧，我那次也是，好像没甚关系啊，哈哈 只要体系加对就行了，再说你的菌不是也长出来了吗？

chochochocho

总结你的情况：载体10kb，从双酶切（去除300bp）后胶回收；插入片段900bp7 {+ M5 i9 ~9 g# c: H* {' Y' F
问题1有关300bp杂带，1，引物是设计在载体上，插入片段两侧吗？做了blast么？2，胶回收时电泳是什么条件？怀疑你的双酶切有问题，10kb与10.3kb在胶上也区分不出来。3，所有的克隆都有300bp条带？* D+ t/ M2 t1 h7 y
问题2，赞同沙发。再有做好的抗性板儿1个月内用完最好，久了也不好解释问题。
+ S! ?1 }- g# D& ?

sidalin301

回复 ghfvcat 的帖子
: r7 b! g2 [7 E7 m* s6 R. \9 i# k" x" u9 b' C) s; c  z% T; n6 k; B9 L
大概有18 个小时吧，时间久了为什么会长出卫星菌落？抗生素及其浓度没有问题，我做过对照，没有转化的细菌就没有长。

sidalin301

回复 chochochocho 的帖子+ u9 V/ _& U. d+ U
9 g3 _/ R$ v6 k
引物两端带有酶切位点；没有做Blast，因为带酶切位点的引物无法做；几乎大部分克隆都有300bp的杂带；双酶切时就见到2条带，300bp和10kb。

sidalin301

回复 张也行 的帖子
& _# k3 B2 z9 ?) s7 {7 R) q* c! q+ P  s1 [  e6 H
不像是污染，大部分克隆都有300bp的杂带；fermentas的连接酶的说明书上说粘端连接时酶量为1u，线性片段环化则加5u，我怀疑是不是加的酶量多了导致载体质粒自身环化？

张也行

5 F* m- t8 V  e7 A% s2 C
2 v& E  k' n8 y- l& h
回复 sidalin301 的帖子
7 @/ K" D5 \& k: J
' N) J* h4 S1 h6 u: J载体自身环化很正常的啊？ 你可以载体去磷酸化防止环化

ghfvcat

回复 sidalin301 的帖子
. x) ^5 N1 T" j' L  \% W9 l" v1 _+ T/ O" e$ @
大概原因就是菌落周围的抗生素被破坏了，18小时应该还可以，挑的时候挑大的克隆就行