请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上% a6 D: R1 c' v9 l) W# }: s8 ^% q
感受态问题已解决3 _" v3 g+ [# s4 x" X, R
关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条
" r8 v+ k; i" q" X/ N% \可最终结果是——0条
7 q# }! A" J( j  V哪位大牛能给我解释下
* O# H& [0 g, |2 m# Z. PP.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

chochochocho

4 m% P$ U+ s0 W2 T0 N" k! Y0 F

1 B1 C% I; \9 N: @我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

mckf111

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% M* T  d9 x: E1 u7 f) D: T3 A我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。
/ \1 F, b. O: g可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

chochochocho

回复 mckf111 的帖子* U" b, z9 ]/ L! H+ X+ @! ~6 G( M

1 Q/ y! s" O4 D6 p7 f7 A4 }4 v你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

mckf111

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/ v- P: o4 k: y# ^/ o4 G( j! [) o% i  h, W- V' R9 {% {
谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？
& D5 f% I/ _+ ]( `1 g% P* N但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。

chochochocho

4 \  m8 g" k+ i: K8 i- V8 f2 a6 T; [( H! g5 R/ [* G3 N* N! c7 e" W' f* _
Milli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

mckf111

回复 chochochocho 的帖子2 P4 ?3 Y: Y5 a0 x' _

/ o% m% c" r+ c' e5 [/ ~4 M( \" w2 \8 m原来是超纯水啊～～
8 F' O$ @2 _9 `# D$ z$ A做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的
5 Q3 h9 y+ ?- K“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详

chochochocho

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。; T/ g+ N6 s; A! J7 G* l9 C  r
比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

mckf111

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& }8 k% n+ y# [7 k- \) a! K" m: p6 x( ?6 X( J- p
那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。
0 D* u5 T# l' O6 c2 w) B另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。

chochochocho

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。