关于插入多克隆位点的问题

军医

9 d) s- y* y+ l# n. u7 N9 d5 P' p
8 e. e! W3 f; O: h
我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

cjyifan

学习了，谢谢！！

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低

a86856635

" ~* A  z, p3 z4 r, i
; m9 e: I. y# L8 G* _应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。
* B) D: r2 V; M* D( K! O你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子
; N' p" `+ F+ k7 G
$ s- a4 w1 _. ^, a  Q, v, d我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
( e9 _" [+ E5 x# KR:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA+ Z% M) Y7 m  E) p
是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子
% {* a$ O+ [$ Z0 p" V+ n8 F1 ?" f- t) L; K4 O  t; U5 l
8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子
7 l& G8 L% c0 B( x7 J/ I& A, I$ Z8 h% v. C
呵呵  恭喜恭喜( m/ p, }8 l- q) {2 ]

8 m) X4 X3 i" j+ p( ]6 c5 Z1 c静候佳音

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子; v' ^7 R( V* j  `* X+ k! A7 j5 Z1 p

7 t8 r/ `' r# t# @0 x: @1 p+ |1 q谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子' I& s- g9 ~; z. W) Q8 G% v

( u" P' f% f- wto 军医兄：
1 H8 |0 ?* _4 S0 Y) k. f7 s1 j: e6 J3 R4 G) s# c
     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？/ ^6 M2 S6 F8 U4 Z& Y

( A; U* r2 v+ q0 ]     我个人的经验认为：, u+ m. @, @. R

' s, \! X4 H  ]! `8 ?. A) d; t: p     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。
) c2 C0 e5 g; ?" S7 J& M7 M6 {& M, Z% c; \: {
     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。
" M6 _( G6 v, Q! @
/ G( h% ^  l1 Q1 m" |         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。
. A6 f9 c: u: j) F. ~8 p. h6 y8 U$ r3 [1 Z( i
         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。4 u# u& u/ @) |- ~% r# Z

  _, C% G# [& F- t( t) y- ?     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。& M- |1 P6 \2 c0 m/ m" z1 F* }* ]

3 [# m4 @: x0 w     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。
& ~& k% _& u! [; z  `' @7 Q; L% @$ W$ C& x+ v

, a& T' H3 O- T" k0 Z! W+ S     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子9 d+ d* _# E) l8 {
4 y  l1 A% T) v2 T; F
单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。
1 i, M8 E8 L: V+ Z/ @8 E退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
; H. ^* ]7 y. [2 \3 e0 H% M! R另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？