关于插入多克隆位点的问题

军医

& P& J: M& ]2 R  i: T0 P
& H4 n1 t3 L% }: B6 n$ q& H* N) \, B我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

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9 C5 D3 D6 O& g/ g% h# t5 x$ q2 k9 Q
to 军医：% C& d! ^% v5 J& |

3 F+ b. {5 r4 L- A) \    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
9 L; @! W" N& Q! u* J5 q! s6 r6 ?/ Z
    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。( v5 ]5 l3 ]$ c' \4 @; J8 G" ^4 f9 Z
9 X2 X  W; S$ K/ O# m
    1. 你退火时的buffer是什么？
1 _* k: M5 q! H9 c5 s. y/ C+ D+ h7 B1 m
    2. 退火温度为什么选择72oC ？
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    这两个问题是你此次实验成功的关键。2 X, U  e5 }. N3 c1 Z( T
3 [( _- O* ?. p; t0 }" P& o% Z1 N2 Q
     欢迎继续交流，共同进步。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 `8 d& x) _4 z/ x6 W( @" t; I

6 k0 f3 l: Y. _1 g7 N; L单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。
" y9 V& G" c) R4 K! c8 O: D退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
8 A# Y8 W: f5 V( i- C9 p另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

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4 h+ H8 u$ E- `2 T
' U5 i6 `7 Z% t4 dto 军医兄：+ F/ i1 ^$ U# e' y

. w' X) U3 p& A+ ~     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？  C) U; K- s& Y
  c2 J  k4 G3 b9 e- T) |0 w1 a+ c
     我个人的经验认为：
# Y! l) ^) I! P
+ K5 W0 u! x$ H6 V     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。. Y( Q1 j" }+ ]; \

5 O$ a1 {7 \& g$ l4 x     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。
! C! _3 c! H- h. }3 ], v/ c& w; _3 g
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。  r6 [8 n8 P- u; \1 z

# p1 ]7 F9 C% ^  Y% [         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。; o6 L$ q% U8 Z& S( V4 D, V' x* E
6 ~* N0 d) q' C
     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。2 b4 N0 r6 S- c/ n$ a1 w
8 c7 y% N* N+ O" u2 ^) ?
     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。- t, U  i7 h  n+ G, A- H' ?

& w. S) o+ M8 c
% \  g/ Z; h& t8 n8 J     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

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8 N% V3 l, M2 w8 V& x% N! Z谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

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" H) }0 x" f. t8 d! H% o" m" Q, M& y) W: {- d0 [
呵呵  恭喜恭喜4 f3 p  @+ C( J

9 A+ \% U8 i) K静候佳音

军医

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* O, c6 Z) s, U: H) s3 H3 w% D
$ D: N. S* Y8 I2 j+ L* G) j8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

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5 s; U& z$ X# P# Y
1 P5 t; p( L: |2 p* x/ J$ U& |我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA
; d/ r/ K) G  E  bR:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA( ]/ S- [' A  ]4 T) L8 e
是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

- G$ O5 \2 x' p6 H0 \
2 \2 C5 P& c6 }3 Z8 Y3 J$ [5 l应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。
6 B) v* j' d" {! R7 d你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低