求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

请教下如何冷冻干细胞 怎么操作和需要哪些液体 谢谢

nculsa747

自己先找一下嘛，非常简单。90%KSR+10%DMSO。细胞冻存液有现在的，如cellbanker、millipore都有，去找一下吧。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。- l: Q' d" Z8 }! C0 `9 g% \) y- O
细胞冻存（缓存）8 ~, F" ^1 I- R$ F- n
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。0 B+ a+ o0 y: l6 b3 S6 h
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
+ {. z' t1 ?) s' B* U. v: u+ N* ^2 Z2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:72 g4 `& H, |" f- ]" {
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。- R$ V% s' R0 v
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）# G0 j5 y1 f* l# T& E- z- M7 C6 ~

( c5 {7 O/ y. a1 O. j* m细胞复苏（速溶）
& B  S5 z# s3 S) s冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。' g3 f5 C$ w9 |  [2 P% F. ~
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。0 {% v4 b$ j' j/ f/ r" t
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％
( o6 `' v# e" w+ A# R

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：2 E3 M8 k( ~4 J; `3 c- l( H* s1 q8 K
1.提前将保温杯放入-20℃待用.7 v0 T: I* Q% l: l1 e" E
2.提前两小时给干细胞换液.) V( K) T) G  t2 h2 G# E& U+ s" V# c. y: n
3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
; b6 y2 c, w: C5 u; U' A4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。+ J; x0 A3 k& _
5.加入1ml培养基吹打均匀
- L7 J( i2 A& j. r: J5 R4 N' _6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。% }' x- F" o0 Q+ w! I) ?1 t0 N$ u
7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
& k/ H; ?; x+ O2 X) j% c1 F8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。
& b- S1 V% D; W! i$ e9，送至-80℃过夜。; v& b4 Y  I4 V; ]6 s0 T" f
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。
7 Q! f8 E  C* [' m我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

congxiaoran

回复 王乾 的帖子8 L* B( O: B2 N0 ~' l

6 g, [0 e/ H8 D* `: l非常感谢

congxiaoran

回复 随心 的帖子6 E; D& E, R0 P' b+ D9 j- Z) T

4 A& g3 x5 L1 G# h5 ?5 S1 K多谢 受教啦

congxiaoran

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' ~' ?% n3 f' Q: n5 \# Y1 M7 @7 C: h0 g& }8 d/ r+ e0 L0 C1 ~
谢谢

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子2 C6 d; H% E2 [# G  a: _' B
2 T+ Z% \/ `& g' |
不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

nculsa747

回复 congxiaoran 的帖子. z/ k0 J+ s$ T" [
+ }/ g5 k2 W" d/ M! c
knockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。