流式免疫荧光检测

future007

8 u" E! e( p* Z3 M: r/ l4 [

0 P, X) E! m* o8 |3 M' g我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
" Y( P( P; {% }0 b' e①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。- b5 b  J. l, Z3 E7 s) Y
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。. C, V0 i: m$ ]! l" H
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
( `  m, J6 A: ~! J! j# u1 k. x④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
4 X- o( o& x8 O' [0 t9 f⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。" M3 K0 o: N" ^  c% W7 B! [
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。5 d5 s" E. @" R1 ]& P
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。  Z7 v& J' i. o! _  P
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。; ~" M5 F- V4 T6 d" h5 ]
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

RIVA2011

首先，第一次和后两次的染色方法一样么？有什么差别？为什么第一次阳性，二三次就阴性了 ?5 C5 p$ |2 \1 I/ u3 f4 U9 L
你的方法中，我有几个疑问：$ f. u* ^4 m* k# a$ a' Q: i
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温（为什么要固定？）固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
4 R3 A5 e3 a% E# E5 L③        用1 mL含0.2% Triton-X100（检测的是胞内的？）和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。2 x& D& g7 F; `0 a' u$ n/ ^

骨道边

做流式为什么要固定呢？固定细胞是为何？

future007

回复 细胞海洋 的帖子
# ]7 ]( f4 b* d6 n" h1 A% d2 k9 _2 b+ W$ f
谢谢斑竹，已经改过来了

细胞海洋

回复 future007 的帖子
/ O* C" w  g3 x6 b2 f( J7 d" K
3 ?% \7 [# ]7 u7 p( E" R% ~已经修改 看一下

future007

回复 细胞海洋 的帖子
! A+ z$ Y) p6 V. l0 L# \4 E3 @

是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阳性结果

中的阳性改成阴性就对了。谢谢斑竹

future007

回复 daviddow 的帖子' ]+ o6 B! ^# V* S
$ S, d: X7 ~0 R* y, g) y2 H, }
我查的一个外文的方法，具体网站我记不得了，不过很多相关的方法都需要固定，你说的不需要固定的那种我也见到了。不过我选择了保守方法，呵呵

future007

我做出来了，不过都修改了很多地方，说出来和大家分享一下啊。4度固定8小时（可能不需要这么长时间，但是我是为了调整我的作息时间）0.2%trition+5%山羊封闭血清通透15分钟，一抗4度过夜孵育，二抗室温两小时孵育。就可以了，以上是我改进了的地方，希望以后做流式分析的同学可以借鉴。能少走点弯路，谢谢大家的帮助

guosapphire

首先，你需要弄清楚你的抗压位置，是胞质还是核内？位置不同可能需要的透膜时间有所不同。& ^4 I) V. h. O; [. v
然后，找个阳性对照来判断你的操作有无问题；
* D  u% r7 u5 ^$ o: B最后，你可以尝试延长一抗，二抗的孵育时间和温度的改变。个人认为，既然你的细胞染色前已经用PFA固定了，根本就不需要后面的冰上操作了。+ K1 i. I* g% u

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？