流式免疫荧光检测

future007

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1 ?8 n5 a: y% J我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
1 c& f& z2 U7 _4 ]2 i①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
6 W% `, A% c, m& b; ]% A②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。# E4 A  a& e- @2 T* }
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。0 V! w. L4 P' R
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
# Z9 V6 g& F7 B" `- E/ U- Z! C5 r⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。- n  Q) M/ n9 U2 _+ j/ ?1 |
⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
: A6 P" n8 N/ t* A- y" W) ?% n- V# S⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。8 G; R% s$ O- j% d
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。
6 L0 I" D1 ?; I" b% i( z4 w  B我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀9 A0 G+ }4 e- x: b
看来你有悲催了6 R/ b7 g3 k" e# ^
要不在试试做一次

future007

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# e0 r% ~  W6 f
# C. ]7 h  A" T8 \我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了
8 W; T  u# H; _" U5 r( \3 x

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

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0 `' O/ n  l( E& A7 T9 R; k& M. ^6 o9 g6 l
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 / X" B# T7 Y) S
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

9 R3 E7 Z3 ?' d上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

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  A' b+ \+ p+ Q. T7 A, S/ o% J( F! G0 m' h" k  n( D
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？