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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-1 11:45 编辑
9 m4 s. z# e0 r% O
% W, X- I" t0 j' Z( b/ `我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：# h) l) s: Y! c& Y" |# @4 G& Z0 u$ ^
① 收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。$ Y8 Q6 F/ d$ A) Z2 B/ N
② 用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
2 r/ N6 v, y$ Q% e8 F% n2 E) g; n③ 用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
( A, z2 G" n% v" |8 g R2 s④ 加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。* x: X3 g% Q1 p: e4 Q; ]
⑤ 加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。. E5 o" g: P. f1 _. ~ b5 {
⑥ 加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。 F A. @0 v; A6 [
⑦ 流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。
8 u4 V* F( U4 [3 Y9 z) T6 r @我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。1 ]& i5 P1 R+ B- o
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。 |
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发表于 2011-5-30 09:23
发表于 2011-5-30 09:38
发表于 2011-5-30 15:12
