流式免疫荧光检测

future007

1 U, F  m1 W0 y  g
/ G& m5 N5 ]) N# C5 b我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
4 k% f, b- M* h, o* t! e3 c①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
# u& f3 E$ a: \  x0 U  k②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
* I5 w% ]1 O: ]# M' d* A% E* A③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
5 b0 B3 |# t; v. l/ P3 j' H( x④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。" u1 K7 T! @7 f, _' m
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
( o8 d2 O% T. O⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。& ^2 Y/ y* h3 G
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。
) T/ X, Z9 x2 d2 H8 [我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。2 B# _& T6 v( T& W
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀$ }* J* s  I  N1 o& p) x; v
看来你有悲催了! s" R% S, T: C$ ]
要不在试试做一次

future007

回复 jhu132llh 的帖子
+ O( [2 ]9 \( s1 }: U1 L
) |8 W/ k: A. D& D我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了8 y- N8 I+ R7 q

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

回复 czzhaozhu 的帖子
* ^( W& f+ J8 a, x) {1 a  [, V4 o* P7 b; k  K
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23 8 x. V. l  ], B# a! `0 x
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

& d/ l5 _% s* j& `9 v, ]上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

回复 future007 的帖子
' z% l/ @0 k! H/ N1 I( b% w
7 d6 o$ G" Y: B: _$ m具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？