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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-1 11:45 编辑
1 ?- g; `. z7 e
& u4 r2 W6 }2 D0 Q' G2 l我最近在做流式免疫荧光检测,但是遇到了问题,第一次虽然出了结果,但是由于阴性对照做的不好,所以没有敢下结论,第二次和第三次就怎么都染不上了,具体的方法,如下:
( c. j% u. O$ r1 v8 |4 x① 收集2×106个细胞,用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次,800 r/min离心5 min。
% i: d- b7 r- u, A; ^/ E! M② 用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min,800 r/min离心5 min;2 mL PBS重悬细胞,800 r/min离心5 min。- O7 h$ h, ]& I6 i% q7 ?+ w3 {
③ 用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10 min,800 r/min离心5 min。1 J, p' m4 D, B' N: e/ V
④ 加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40 min,800 r/min离心5 min,用2 mL冷的PBS 重悬细胞,800 r/min离心5 min,洗去未结合一抗,重复1次。
7 f. y/ Q; {% w1 C) |' ~⑤ 加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置40 min后,800 r/min离心5 min,去上清,PBS洗涤2次。
7 T. I, ]% B6 M/ ?6 K: A) V' t; r }⑥ 加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。# W, r, y4 L9 L8 j5 y
⑦ 流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。1 O! \2 S: [$ s F& e: U. G
我想让大家帮我分析一下,是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果,一抗二抗的种属问题不存在,一抗兔源二抗是驴抗兔的,没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的,反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释,二抗1:1000稀释。6 v/ |- [" E* [9 f: G
我实在想不出来是哪里出了问题了,希望大家帮帮我。谢谢了。 |
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