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[请教] 流式免疫荧光检测   [复制链接]

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楼主
发表于 2011-5-30 09:23 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-1 11:45 编辑
1 ?- g; `. z7 e
& u4 r2 W6 }2 D0 Q' G2 l我最近在做流式免疫荧光检测,但是遇到了问题,第一次虽然出了结果,但是由于阴性对照做的不好,所以没有敢下结论,第二次和第三次就怎么都染不上了,具体的方法,如下:
( c. j% u. O$ r1 v8 |4 x①        收集2×106个细胞,用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次,800 r/min离心5 min。
% i: d- b7 r- u, A; ^/ E! M②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min,800 r/min离心5 min;2 mL PBS重悬细胞,800 r/min离心5 min。- O7 h$ h, ]& I6 i% q7 ?+ w3 {
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10 min,800 r/min离心5 min。1 J, p' m4 D, B' N: e/ V
④        加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40 min,800 r/min离心5 min,用2 mL冷的PBS 重悬细胞,800 r/min离心5 min,洗去未结合一抗,重复1次。
7 f. y/ Q; {% w1 C) |' ~⑤        加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置40 min后,800 r/min离心5 min,去上清,PBS洗涤2次。
7 T. I, ]% B6 M/ ?6 K: A) V' t; r  }⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。# W, r, y4 L9 L8 j5 y
⑦        流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。1 O! \2 S: [$ s  F& e: U. G
我想让大家帮我分析一下,是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果,一抗二抗的种属问题不存在,一抗兔源二抗是驴抗兔的,没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的,反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释,二抗1:1000稀释。6 v/ |- [" E* [9 f: G
我实在想不出来是哪里出了问题了,希望大家帮帮我。谢谢了。
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沙发
发表于 2011-5-30 09:38 |只看该作者
好像是没问题的呀
+ x* U. c3 J, X0 e3 U: c  y7 h看来你有悲催了& m8 Y+ B5 Z3 W& U$ E( J
要不在试试做一次
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藤椅
发表于 2011-5-30 09:45 |只看该作者
回复 jhu132llh 的帖子' Z& i' c9 F" C: o8 w  T3 i/ k

9 I$ d* ?  W2 S9 [* B我都疯了,做的叫个郁闷呐,死的心都有了) v7 n6 L/ N1 Y6 j

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板凳
发表于 2011-5-30 10:15 |只看该作者
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你的样品都没有染色就是阳性结果,那你试试不加任何抗体,收集细胞技数后就上流式看是何情况?
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报纸
发表于 2011-5-30 11:48 |只看该作者
我每次流式都是没有固定直接做的,而且,一抗二抗用的直接标记的,这样做既方便,结果还比较准确,就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些
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地板
发表于 2011-5-30 12:40 |只看该作者
回复 czzhaozhu 的帖子0 ]6 p4 E8 d3 n& _. z: K
! I. K( q6 r/ o0 c2 O  @0 n2 U
说错了,都是阴性,不好意思

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发表于 2011-5-30 13:53 |只看该作者
future007 发表于 2011-5-30 09:23
, v. R$ l3 h% [: V7 [我最近在做流式免疫荧光检测,但是遇到了问题,第一次虽然出了结果,但是由于阴性对照做的不好,所以没有敢 ...
3 d, v8 P0 h- i; I
上面说错了,我的结果全是阴性,不是全是阳性,对不起了

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发表于 2011-5-30 15:12 |只看该作者
回复 future007 的帖子  R3 p2 |9 }# l' E! }' V: v6 m
. ~! x; s" _$ p/ D
具体说一下修改哪里? 我帮你修改

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发表于 2011-5-30 15:22 |只看该作者
抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧
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发表于 2011-5-30 17:15 |只看该作者
2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定?
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