流式免疫荧光检测

future007

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我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
: u$ S$ f9 ~$ J* N) `①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。4 s2 w5 S! i! @1 ?
②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。
0 G) I2 \' q% Z8 t' X③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。5 F( ~) V1 O: H9 t
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。( `- @  d, I& L( G
⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
5 |# [+ d6 L3 O8 s  h" E0 g; `⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
/ v+ b" @! D/ r⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。4 B3 F; T, U& L) y( z" o3 I
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。
4 c2 f- _1 v) O+ k6 m我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀. q' l* ]6 z/ ~9 H5 S+ Z; Z; c9 @
看来你有悲催了2 C2 d: f9 w+ D
要不在试试做一次

future007

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5 O! b6 M. A+ m8 t, k& y$ D5 k: h& I* G" s. P) {
我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了
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czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

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8 v+ u+ o6 X3 S1 |/ W6 @0 v/ w* L  ?. x  R* e/ Q6 P8 n, a6 R# O
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23
* @5 s# @( H9 q& y# i我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

6 S' E5 G2 V% |0 d
上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

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' x; X: D  f% L$ G8 I- O+ X6 E
) K2 a+ P7 w/ h1 x& J具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？