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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-1 11:45 编辑
# K, z) S; {+ |3 a. H, g5 V% `. N0 H9 l
我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：* ^, r0 ~9 b/ s
① 收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
! p9 L2 M) I8 M0 f) D- H② 用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。3 M6 t4 R9 D* c% n
③ 用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。
2 ~% E& b+ }' G" z( J* T④ 加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
6 N: a; ^3 R3 y' j0 Z⑤ 加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
, I, t0 _6 m, S" c/ L8 i⑥ 加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。
$ _4 U* d! y" Z4 {* D" G⑦ 流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。
* N% d: g& ^2 B( x8 B我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。; r* y! |7 T. P* M
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。 |
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发表于 2011-5-30 09:23
发表于 2011-5-30 09:38
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