流式免疫荧光检测

future007

1 ?- g; `. z7 e
& u4 r2 W6 }2 D0 Q' G2 l我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢下结论，第二次和第三次就怎么都染不上了，具体的方法，如下：
( c. j% u. O$ r1 v8 |4 x①        收集2×106个细胞，用冷的PBS 2 mL 洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min。
% i: d- b7 r- u, A; ^/ E! M②        用2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min，800 r/min离心5 min；2 mL PBS重悬细胞，800 r/min离心5 min。- O7 h$ h, ]& I6 i% q7 ?+ w3 {
③        用1 mL含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10 min，800 r/min离心5 min。1 J, p' m4 D, B' N: e/ V
④        加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40 min，800 r/min离心5 min，用2 mL冷的PBS 重悬细胞，800 r/min离心5 min，洗去未结合一抗，重复1次。
7 f. y/ Q; {% w1 C) |' ~⑤        加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40 min后，800 r/min离心5 min，去上清，PBS洗涤2次。
7 T. I, ]% B6 M/ ?6 K: A) V' t; r  }⑥        加入0.5mL 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。# W, r, y4 L9 L8 j5 y
⑦        流式细胞仪检测荧光值，每管计数10000个细胞。1 O! \2 S: [$ s  F& e: U. G
我想让大家帮我分析一下，是哪里出了问题才可能导致我的样品都没有染色就是阴性结果，一抗二抗的种属问题不存在，一抗兔源二抗是驴抗兔的，没有问题。通透液配置时间不超过十天。多聚甲醛商品化的，反复冻融三次。二抗避光4度保存。一抗是1:500稀释，二抗1:1000稀释。6 v/ |- [" E* [9 f: G
我实在想不出来是哪里出了问题了，希望大家帮帮我。谢谢了。

jhu132llh

好像是没问题的呀
+ x* U. c3 J, X0 e3 U: c  y7 h看来你有悲催了& m8 Y+ B5 Z3 W& U$ E( J
要不在试试做一次

future007

回复 jhu132llh 的帖子' Z& i' c9 F" C: o8 w  T3 i/ k

9 I$ d* ?  W2 S9 [* B我都疯了，做的叫个郁闷呐，死的心都有了) v7 n6 L/ N1 Y6 j

czzhaozhu

你的样品都没有染色就是阳性结果，那你试试不加任何抗体，收集细胞技数后就上流式看是何情况？

lizzy_81

我每次流式都是没有固定直接做的，而且，一抗二抗用的直接标记的，这样做既方便，结果还比较准确，就是不知道这种直接标记的抗体是不是贵一些

future007

回复 czzhaozhu 的帖子0 ]6 p4 E8 d3 n& _. z: K
! I. K( q6 r/ o0 c2 O  @0 n2 U
说错了，都是阴性，不好意思

future007

future007 发表于 2011-5-30 09:23
, v. R$ l3 h% [: V7 [我最近在做流式免疫荧光检测，但是遇到了问题，第一次虽然出了结果，但是由于阴性对照做的不好，所以没有敢 ...

3 d, v8 P0 h- i; I
上面说错了，我的结果全是阴性，不是全是阳性，对不起了

细胞海洋

回复 future007 的帖子  R3 p2 |9 }# l' E! }' V: v6 m
. ~! x; s" _$ p/ D
具体说一下修改哪里？ 我帮你修改

a86856635

抗体孵育直接静致是否结合不牢。整个过程都应该转盘悬浮比较好吧

daviddow

2 mL 4%多聚甲醛室温固定细胞40 min?为什么要固定？