细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验% r* }" |9 `" L3 c9 o) R
                                             
0 j7 s1 ~; \* L$ t  Y1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
9 r  y- I% d, V: ^8 D2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
$ P% f$ l& V% |) c2 [' A, N3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子' O/ _0 O( {( d# o* M7 C
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
! M( x$ e: q; o2 `# D0 G8 U5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
. H% R  {& ?4 m+ ]! O1 ?6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
8 \& D" x- f; R7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
2 r. c* x# P+ g8 ~2 S9 K1 N" C8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
# G* h! m- y2 b4 ?9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。5 w* v0 P% [1 N! d% p7 V, k
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。4 k" o) |; C5 }: b
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).+ h) m+ x/ V$ u  B2 D
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
( F* l  E$ V* q+ C: `) ^13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.
1 h! v4 T! _- ^& Z6 F2 g+ n14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
7 {. p' @) e; u$ {15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。$ T, I' b/ J  A- p) Q$ Z  d7 l& Z4 K
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.$ V2 L) A2 X1 g" \* D: u* M
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。  X  T7 g+ R" |

- j& t5 ]2 d( Q) h, y' X7 T5 U                              培养基血清浓度
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   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。9 |$ p  l' F3 T$ N

0 n. g1 \0 @# t' R& [+ A/ M6 M5 _6 j# q                               6 d8 i3 j/ X2 ?7 g7 a: N; N, R
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                               污染的处理" Y# x5 R- w# e) \

8 r+ Z# v6 y+ O& Z$ d( I5 H4 v污染现象：
  B, E$ E: J) q    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
3 ]) @) K: J! W' Y' @解决办法：: ~4 C; q5 P, y5 J* t
1、扔掉细胞
7 B6 s0 d! e( F* m3 s2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了+ p& V- V8 n) E& E) H# M
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过: r6 p+ s5 ?$ T' ^1 r. j
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
: ^( d: L  Q/ Z6 F* T5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
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培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！' M- P3 |; C! Y$ F
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；; u  M5 H8 e( u" ^" E0 o4 j$ N6 T, Z
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！
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hub12333

回10楼，我的经验是用血清终止消化后，离心，再用PBS混匀，再离心，这样就可以了

琛儿326

回复 mayuan3012 的帖子" Z4 \# x' J1 v; K/ J; z
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应该是离心后，用PBS重悬细胞，再离心一次

cypan

不错，谢谢分享

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”6 A7 X& I6 y8 Y' \# V# P
消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

franty

回复 xiangchou812 的帖子- T$ K7 [6 l0 G* j
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同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？