细胞培养操作经验

4445655

细胞培养操作经验
4 H5 c1 Q* c+ r1 j                                             
! a) y/ k* X7 w% B* R! i1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题' R3 v  d$ V! H) [& B
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
3 m3 t" `! f4 k  _3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
% e0 F9 s1 _0 ^) M# u, i4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）& o9 w" u' u) n; r8 o* Q
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
1 g7 d5 w3 {0 ^5 @6 }6 ~* r6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁% I+ k2 I8 A) c- i& E' [
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。7 \( P7 `# H1 W( g! F+ o
8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。( K( \7 W7 I1 w+ c( v
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。5 e/ ]  X$ q/ k9 H
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。
, |( D% [  s1 D1 b% p) t0 m3 j; ~11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).* O% K4 q$ u7 s$ Z: l' ]
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基." N+ c  z' j3 ]' I% E
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.
) [* _$ c- v+ R# A7 q14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.9 E# Z! s) \! L1 g
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。5 D* V0 ^% |3 _. r) k& b, e% m" D
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.5 z6 K$ \, V; p% p2 z* e2 ]9 v7 f
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。0 [9 x' n* D/ [) ?1 G  i5 R

1 _9 L# N9 d. I                              培养基血清浓度8 F7 [7 l5 K6 q5 [
   9 S) h+ E+ G" V1 Q3 ]3 g
   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
0 O5 y$ S- a8 d  U. ]& j" ?" \/ B# n, z0 b% j0 r
                               / {3 ?0 R% _  A0 A* _+ l. k. ]

( n& d5 H- r* B                               污染的处理4 e" M! d3 G& `8 m" N" K
. B3 y$ X/ a5 r  P! u" J9 s+ j( ?8 x
污染现象：5 p. o9 T$ X2 l1 J8 P
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
0 g8 P8 h% `. }3 }1 e解决办法：7 u, e) t' P; ^0 ~0 \+ n1 K
1、扔掉细胞6 k/ {( G% F, T+ h  g7 r' A
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
* |5 H8 I' @  {; W% B5 P3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过" G, o1 |5 I3 f- b) ?  _" P
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试4 I" B0 h" n$ C" _! D
5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
1 }' L6 S4 R1 n) k; p
+ D; V6 V* ~& j  G4 S培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
0 D' B, a. A" u前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；
- b5 B, s) p) A+ K2 P/ M3 G* o5 i具体可参考，培养箱的操作说明！！！！
) N5 B0 P. m6 z/ |, u/ _! Q$ x9 u4 P9 k+ B& d9 C
+ u- t* f4 x* g7 F

3 f  k) ]/ T. V+ O  L. y  U- B' V. y

ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子& B+ G4 x# [; J/ m) T# R

7 W% P$ v# K1 R1 |1 i: \! R同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”' N& q: L- U- w' B* y' I
消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？