细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验
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1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题
& p% @- P7 r; b2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
# k3 k. s. ^% B3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子# }2 f( B  `2 Q& b" N! Q
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
1 A2 ]8 H: h3 f2 z5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
; @3 a" b' N, v+ q6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁6 G! j/ C$ s. d
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
" }. l8 f6 ]5 F% i; u" H8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
3 F7 t. ]# k$ K' O( H4 r# E9 a9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。0 ^4 n& |# U( n) m+ n/ |- g" E7 R
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。6 P4 B  A0 g9 I2 O2 a9 ?! l
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).0 B0 ~& o1 @/ z
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.1 |& h, s2 D6 f+ C3 d
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.
$ O5 v  M; V9 u5 d8 X2 R14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
# s/ ~) j) ~5 y$ W1 U( [) e6 Y4 Z15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。- N* c  X- g4 `  l7 }0 f9 }
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.! t7 h2 ?* O! k. P- Y2 t, a
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。% a- g8 z: W7 a  H: i  i7 u! H

( y3 p# W7 c3 Q9 e$ z, v' X                              培养基血清浓度
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+ ^; ^4 u; D7 V1 v% a- u. b   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
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                               ! L: y& r' c' }  e+ I

7 k7 g1 o6 W$ G4 b; G* c                               污染的处理
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; a+ @( o$ c3 ^( L. m; g% V- E污染现象：
# M  R- v/ r2 F: ?* D    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。9 M$ @0 o0 z/ h) V
解决办法：: a- v( ^0 g1 ~! d  M  Z5 u
1、扔掉细胞
, m+ ~6 U6 S% H* ]  X9 P2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
) c* N- D) e+ V' c3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过
  X( ^, v8 d2 D' [" x4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
/ w7 w1 s; @- t6 J+ ?& H) _1 w0 R" B5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
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0 T- @* p% O  j- V) x7 ]培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
* z0 x# E, i$ \6 p( e前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；
0 a( {  C( e& C  E  o具体可参考，培养箱的操作说明！！！！
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ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子
- k6 a: Z% C' ~2 h, A& @$ W! k9 r8 A0 F
同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
% s" U  P7 z' \8 o5 [  ?/ H) r消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？