又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

1 y/ U+ E0 T6 A! N2 K$ e2 _
7 p  ^  y5 e: O& U0 a0 G4 X. k7 t
在此省略实验试剂和仪器设备步骤" Y9 s6 o# s4 ~5 O7 g
成纤维细胞的制备! P# R5 C4 N- \$ D/ E
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
( j, R* N% p" Q& ?A 时间：15d6 Z0 Q$ Q2 B( M5 J" _
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
8 D9 K( q; z7 L3 z6 b/ E. K5 z- U! [（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
, d' k+ d& X, k8 |% E" y- u5 }( e（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min ) O' H* ^" L1 x0 i) w
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min ( [/ P7 l) r$ T; ^' }; S
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
- N/ L1 [. E+ m, o. {（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。" Q& c5 {3 D  `# s) Z0 s
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1); p0 c# @7 {5 u, v
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
" I% ]2 b% U) b% h( i$ g（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and3 I8 Y. `. ]$ @& G; q  \+ Z8 b
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。( S7 P6 k) J; s" b  A
$ `$ L" B6 R, N
尾尖（B）时间：10d- K& D# U% h% s: D# L, L
在此略2 F( I) v5 g/ Y: A
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
) w+ U9 d* g$ h" Z3 x3 Z（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中, F5 [8 p. p' V. b9 m
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
) j: H6 Z" n. k4 o" v（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）4 a2 t+ P4 H& t# t
（4）        160g 离心5 min，弃上清$ _9 o" |# ^; I( @
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO25 s  I" a! i" E# x7 E- J
孵育，直到达到80–90%汇合
( y- N$ C: X8 o" |! j
" m# e* j7 h. R# fCRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。! }) D5 f1 S7 |0 f% {

* |1 c! _6 H; i* o/ pSNL cells的传代 time：0.5h
9 g, a' k5 }6 V6 C（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
6 I8 V4 h7 {8 {5 \* t' s（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
, ~4 ?  N5 p* {6 A5 `* W6 P（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
7 R- O. L2 Y0 A- N（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
, J2 u( C; S7 B% a/ x7 g5 U6 U0 v, C% z7 h( m* p+ J
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h. O5 i' k. R% }, n
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1" n  P# v* h/ |: f5 U
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
9 C% L( H- r; h9 q% u* ~9 k（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min0 i: b4 E7 `4 N( q# t) Q& H' ?" ?
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
2 R  D( R$ d; z7 E- D7 P（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
) f' {, K8 O+ ^( e( FPAUSE POINT, ]6 {' a2 C# y" b% E
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周" y( S! |/ g0 c' V% }% Y" K# q

( o, B# q7 x0 h0 H4 M解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
0 h, Y  u0 ^$ y（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中! n1 E: k7 K: n( y$ c. U2 ?
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
" k# v3 X' p6 H* E# \( x（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）/ P* B9 @5 S8 k6 t& q
（4）        160g 离心5 min，弃上清. q: h+ m. W2 C
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
+ E* _& w5 c9 h. A) _2 b) v（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
" [6 C! x6 _9 `" n8 i- m0 B# S' q" c
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
1 G3 a/ _% R8 P) z1 z3 }- b. J* \- ~（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清3 o* r6 B- R& J4 A5 V
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
& l. f% ~* U6 U& k4 y+ G9 S0 A4 W' oDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
  Q# Y$ v, Z, b（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min/ {& H1 a6 T' T% J* {& {: g
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
* ~9 w* y! I" p. d2 W/ I（3）        180g离心5min" J( {: I$ v& e- b( Z
（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
8 e1 z( Z7 X+ |, j  S- T（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
1 l# `  _" j, v- h# c（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
: k4 o5 ]" b9 t  iDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
7 w0 f1 A# w- B3 E（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube; p4 H- x" C5 X
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min% O# T. r, {1 z8 N+ [7 x1 r
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
  ~) A) k& u% K/ _8 M7 C（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜( I5 l' u; g' I; O4 ~
2 {4 Z/ d; B3 ~, o- X7 e) ]4 b( M* C1 L4 ~
关键步骤. W3 @. x. k% h& H, T; {" i
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
' X2 w, W: D; Y) z5 G! D2 b: |; ~% U, t& U2 z- [$ `: w  j+ u& I
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
" H) }4 {1 E4 [) \! ~吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
( f% t+ t/ P9 x& wPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h
+ z7 N; W1 y: y$ W! e! R（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）! y7 f8 x2 ^  \5 E$ `
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗5 i, G% E8 V  e" _# a1 u" I
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
1 K1 ~  [3 J8 a6 q（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中5 n2 B! _$ e  R( W6 u7 \, ~9 r, d
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。1 f+ x- ?, g, {1 D( F
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
) F$ w# [- S; ^: H8 c（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
  x6 {. K) o. f- a2 H- N7 H（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–10 ^3 n& |/ d3 a* ?, m/ X
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.0 d0 M9 l+ g1 Z
关键步骤
+ q) p" x, Q& S4 W" J& kRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
/ L+ \3 r* A4 z' ?1 @9 g, H+ H) P  v) X4 N2 |4 X
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜) ~7 z; z" b" n2 i. ~

6 x% @$ F  y; f0 d, c% }! p: t- sDay 5 and 6  TIMING  5 min each day& B) D! t5 K  p9 ?
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
5 }: w8 z; S0 K% O8 u; |Day 7   TIMING  5 min2 j( Z% n8 Y2 ?' o2 d4 U
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
0 ~0 m( n+ \4 t8 H$ QDay 8–10   TIMING 5 min each day
5 ?% A3 F" ]$ G: `, e5 Q每天更换培养基（分别在24,48,72h后）4 @) h$ u# {8 }' G
Day 11   TIMING 5 min9 C  z. O- Y2 a& B; l/ q9 ^/ W
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
; D8 b( e; C; C2 CDay 12   TIMING 约5 min each day7 u* X+ [2 q8 U" R5 A( w
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）0 W) e  r* o+ }" _
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d+ b( V# F4 m, e4 B; M! I  D' K: V* G
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min2 ?% e) }. U5 ]7 ?% \7 x3 F
（2）        Wash the dishes twice with water.  w8 r. J, t* Y0 U
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min, m2 D2 U. i$ [
（4）        Wash the dishes with water
) R' y+ A, ~/ u$ Z: H（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.; @" t2 m% K& H# K

9 a: h0 a) v1 \Expansion of iPS cells  TIMING 1 h
  S' e. Z1 B  Z# I' h3 t6 d（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
9 R/ X+ T: y8 C& j% Z（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
3 o5 ^* |# A% A& y（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层9 ^% ?4 q: w& g2 g1 _6 E
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
/ C  E( z: ]* @: s# |Preparation of freeze stock   TIMING 1 h" E+ V3 n" G' U- E" l% B9 B, D
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗0 W6 `6 J$ [" _7 _0 ?6 u
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
; P1 W& h3 j1 h. z6 {; P  `（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层) F9 y# c  b7 y
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
: G8 a+ g6 _' c( L7 F（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml- L1 @6 ^4 E. ^
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）- B- f! A0 J) c9 }0 E
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
; S2 X2 w4 o& p2 Q2 ^6 B8 d（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）4 M% w: Y' ]7 ?( E; T/ D. J
PAUSE POINT, s  `7 O$ T+ `& _. v% X
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
9 c1 h# b4 f. ~

sunny2829

什么时候的呀？？9 W8 P0 ?. l! F$ F% h3 v  x

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子" x3 e- t1 m: f( A  K7 Z
- s# P# |+ Y* d9 {# u
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子( e9 m2 i, H- K# z" l) W

1 \' P* H5 l1 h" l1 b3 R% B2 @: [呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
" l: Q& s0 K* y这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？$ `# m0 \. c, W) o% H
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。7 s* y; O% J0 o/ {
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？+ b+ t4 e& t0 s
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子) P( K* x1 r$ R1 q% t3 Y8 x; j' M
3 @9 g* T" h& y& R
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
8 a) [- f+ o: S1 o& C6 Z首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是& A$ d% q" K  f6 t1 K. X% O
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生2 Y9 `3 k9 h+ D  M, B
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子
+ l1 f. n% Q* T$ V8 G2 k" g3 a: e: B6 O
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子5 S1 e- ^) \# y. b# `. X1 N
# q7 V- Y" v+ B
没事，相互帮助嘛