关于细胞消化的相关实验操作

突击兵之小土豆

最近做实验，在细胞消化的过程中，发现自己对于其机理和反应的相关条件不是很清楚，上网查资料众说纷纭。主要是对于胰蛋白酶消化干细胞的过程，简单点说，就是用胰蛋白酶加入长满细胞的克氏瓶中（已提前吸取，弃掉培养液），来回摇动，使胰蛋白酶铺平培养面。是不是只要铺平了，细胞就在消化中，不用反复继续摇动？胰蛋白酶的消化能力有那么强吗？才0.25%啊。4 y+ G' c. C" ~/ Y

7 @+ o9 J& D$ J) o除此之外，中和消化许多人采用血清或者是HANKS‘液，其后也需来回摇动，使其与培养面均有所接触。对于血清和胰蛋白酶的比例，网上也各有说法，麻烦各位战友能不能说说各个说法的原因。反正我们是用10%。0 f3 l  h# d0 k8 G4 H& i( W
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最后，对培养面先用混合液（胰蛋白酶和血清）对培养面进行吹打，后用PBS或者HANKS’液进行多次吹打，我是新手，对于吹打有些顾虑和疑问？忘战友指教。个人认为用混合液时，由于细胞已经被作用消化过了，随便吹几下就行，然后用PBS或者HANKS'液进行仔细吹打，对于吹打的次数和力度，还有时间总是掌握不好，时间长了，怕细胞损失多，力度大了怕细胞机械损失大。用一句话解释啊，哥成了一个矛盾体啊，晕。忘广大战友赐教。

阳光正暖

胰蛋白酶使用注意：
7 ?7 h; I: e0 G% c( d, u: z1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。' F5 }& v1 K% L% |& I9 T" ^. L
2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，会对细胞造成损伤，细胞铺板后生长状况会较差。* W' v8 O. b1 T9 N' Q/ i
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贴壁细胞的消化：  G) j# F1 O. {3 b
1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清7 v3 o3 c& C9 w& u& l8 @0 ~
2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）5 _* c" k# @, R) j4 t; e
3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。* }. U& h( {" o, `
4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。
% Z" j+ P" Q% S5 ~6 n如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
8 n: `( t- _* }常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。5 R5 |) h+ ?5 q+ c
影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
+ S; N/ m% ~& R$ U; t$ Z5 a加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；
- O; J6 ~' L, Y  Q6 ]; `! ~) Z* _( r一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。
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( k; B( O% M- p: g0 F' j胰酶配置方法：" H" H+ m' L9 w; u4 f
1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解( H* Z0 v! n1 ~: @
2、生理盐水配制，要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时，调pH 7.8-8.0，过滤除菌。）
9 N/ y) j- f9 B, J2 c3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g，先用少许灭菌过的PBS调成糊状，然后补足到100ml。置室温搅拌4小时或冰箱内过夜，过滤灭菌，分装，4℃保存备用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；2.次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。）) f% @  x3 u" O
一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌，至于作用效果，需要消化一次细胞感觉一下，因为不同厂家的酶不一样，有的作用温和，有的作用剧烈。3 f5 I) u5 B/ c) U- G) X( \
4、是否需要四度放置过夜，取决于你的胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要四度过夜. 而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要四度过夜。从理论上来说，四度放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以出去细菌，可是出不掉其代谢产物。
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胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因，考虑有：
4 T$ D) X2 u: G; p4 }4 x4 {1、过期或是酶已经部分变性
* T9 H7 e0 p: J' l2、溶液ph值不对. o- I3 v9 P8 X# w  `
3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可

blackhei

最近在养MSC，细胞状态不是很好，第二代的细胞已经老化，胰酶消化时比较困难，贴壁牢固，基本不变形，有极少部分漂浮，消化时间延长则已经漂浮的细胞严重受损，出现两次这样的情况。现在想到的是胰酶消化几分钟，如果消化不下来的话就只能吹打的时候多吹打几次，但吹打的时候动作要轻。

细胞海洋

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& Z6 ^: @' [. h  |2 ]- I4 ~% p( `
" o+ j4 {, w" v" q/ B. B建议你发新帖提问

gaojingyu0311

吹打的次数和时间对MSC的影响大吗？

dianying

回复 yangwy028 的帖子
7 a6 ]" l* O$ p. A+ @, u0 @% D& h+ ?* O6 ~5 m2 ^( U) h! _" U7 g# {
你好，
' {& S8 Y/ F5 ~& L# @看见你打了招呼。谢！- \( h/ y& |* {0 g* Q
但是看起来有点可笑，系统说我没权限回打招呼。所以就在这借块地儿招呼一下吧。但愿以后这网会大度一些吧。

yxwfly

我们一般75cm2加入1ml 0.25%的胰酶。* ~. h" r) s0 Z) c! w  L
加入胰酶后，缓慢地来回晃动，使胰酶铺满整个培养面；
! R9 a' k& M- O3 K" p置于显微镜先观察；
) N6 ?( Y+ u% B" i6 e待绝大部分细胞变圆后，立即将胰酶吸出，弃去；
' ?( r4 I" x- `. k+ a- o: }加入含10%血清的培养基终止消化，进行后续操作。
, _9 M. O& _3 i! G7 l
$ K) g3 O3 j# q1 P要注意的一点是：要在细胞变圆但还未悬浮在胰酶中的时候吸掉胰酶，否则就连细胞一块吸掉了。
: P% W7 D; ]8 _这样做的目的是减少胰酶在传代细胞培养基中的含量，降低对细胞的伤害。

zhang0194

这个终止消化的时间是很重要的，我们平时做的时候就把握下面这几点：
8 z- @5 Z: J3 o. m2 h+ S. q  前提是无血清培养基培养的；9 L8 u+ `2 Z7 a; A5 [5 O; q
        1. 消化时间是很短暂的，加入消化液，摇动10次左右就放在显微镜下观察，这需要助手，在瓶底还挂有细胞（形态没有完全变圆，还三三两两的在一起），立刻送入工作台，加1倍的新鲜培养液终止消化，一般这中时候再用移液管吹打3-4次就可以吸出来了，随后再用PBS 涮一下瓶子，别浪费吗。
# ?2 K; ?3 \" ~$ Z0 h5 T8 z% n        2. 胰酶的浓度，建议0.125%,浓度不高，这样消化不是很快，可以留下充足的观察消化状态的时间！1 B3 ?7 S& k. o  [! i8 @
      

cmy008

我是作间充质干细胞的，一般是用用0.25%胰酶常温下消化3-5分钟，看到细胞间隙增宽，细胞由梭形变圆就立刻用等量培养液终止消化，但没有继续作吹打，感觉消化下来的细胞偏少，但后期生长还可以。今天看了这个帖子收获不小，学习了。

aulenuyah

胰蛋白酶的消化能力很强，0.25%就已经是很浓的了。消化的时候只要胰酶铺满皿底就可以，不需要摇动。具体时间与每次买的酶活性有关，没有固定的时间。一般在显微镜下观察时，发现细胞便圆，轻轻振荡之后有少量细胞漂浮就可以终止消化了。终止消化时候的血清没有十分明确的浓度，可以用培养液，大约保证培养液和血清是1:1的浓度就可以了。混合之后用力吹打，可以尽情的用力，不过要控制尽量不要出气泡或者把液体吹出培养皿，直到把细胞完全吹打下来，一般这个时候的细胞贴壁能力和生长能力都比较好。不要等到看着大量的细胞都漂浮了再终止，那样的话胰酶对细胞的损伤太大，不利于细胞增殖。