ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

oucflora

冻存时DMSO浓度过低；
& C7 z! G3 ?. ~* D& Z. u5 ~另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？

evial

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做

Yedan

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( _0 @+ u9 E" U( }8 m' E4 M
6 ]8 H  @0 F4 z5 g" ^* s10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……- e; q; Z: A( c

Yedan

回复 rongrong 的帖子# v6 I) ]1 w' c9 W9 Q# \; J
( F) Z7 A# R' f% i( j) V
800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？
1 M8 M2 ^5 o+ k/ I我们实验室从来都是1200rpm的。。。. g) ~, u! E4 r) {2 X. v

' e7 w7 U$ s2 e# K" e- c补充内容 (2011-9-4 17:27):
( @- X6 u9 a  ]3 l) m6 W另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。

oucflora

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: Y: z( s' o- |, }
6 h" A  ~4 p8 x2 r6 |在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。

jefferson

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了.  对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意:
8 U$ h$ h3 l; O* e, w7 R
7 d# L9 E8 }# p5 J1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.+ o) z" p, t" {- f
2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作
# B, p9 R4 B0 K/ }3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.* d5 Z. F$ g& W* O5 t
4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定. 0 k9 U# a3 D5 _1 d5 y1 a) _
5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.

rongrong

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1 L9 b' v/ `' K2 e
" u% Z: j% ^7 b+ P4 b! _1 e3 e我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。

rongrong

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0 |4 y3 R; e6 U% q' {8 ^6 t! d! s" N+ U2 ~' ?
英文版是啥啊？我是新手，好多东西费了包包但是不能下载啊

rongrong

回复 Yedan 的帖子2 V" @% A- |& E% p$ P
  Z% Z/ G! Y, K& k1 U( ?3 ]2 O4 b
是人的，800转看起来是全部离下来了，我听别人说他们都是静止放5分钟就好，主要我得细胞都变成单细胞了，不再像以前那样一个个克隆了，总是离心，吹打这样不会影响细胞的存活吗？再说刚复苏的细胞这样折腾能行吗？我就是想看看大家都是怎么复苏的？