ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

oucflora

冻存时DMSO浓度过低；
* q7 R! V* e- D另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？

evial

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做

Yedan

回复 oucflora 的帖子% [& E) J' w4 @5 z* R. z  [

5 X4 B+ Y4 k; B& j- x. ^; S* K10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……. f5 S, d$ q$ M

Yedan

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& m8 R( _1 {5 N0 U) r. ]) E800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？
8 C  o9 C; ~- x我们实验室从来都是1200rpm的。。。2 F  v/ P; v$ o: f2 T

; C. f( h% ?+ A补充内容 (2011-9-4 17:27):
0 a2 S6 n1 a- b: ]6 z" S5 {6 R另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。

oucflora

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" t6 ^8 J' t! l+ d0 i
4 h6 i" Z/ e+ k# z$ E# O* \: l在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。

jefferson

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了.  对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意:
# n, N; v$ c: g! c4 f
6 U. h" T4 G( X( R' j1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.
  X# t- h6 m% }4 E7 e" T3 c$ N: W2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作
3 a. [; r* X: B- L, f% Y3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.
$ A, ?, |  v# ]. K+ A4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定.
3 ]7 f. [& d- {9 A. g! v1 t" W& F5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.

rongrong

回复 oucflora 的帖子$ Y2 i: j$ }- O
1 G3 f% ]. V) I! b
我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。

rongrong

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/ m$ W1 K1 O  A3 v
0 {( y( D) f# o英文版是啥啊？我是新手，好多东西费了包包但是不能下载啊

rongrong

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( R; |$ ~% a% l2 z7 `5 ~! |% j/ C) x6 S
是人的，800转看起来是全部离下来了，我听别人说他们都是静止放5分钟就好，主要我得细胞都变成单细胞了，不再像以前那样一个个克隆了，总是离心，吹打这样不会影响细胞的存活吗？再说刚复苏的细胞这样折腾能行吗？我就是想看看大家都是怎么复苏的？