MSC 冻存问题

andylee824

近来，MSC复苏后显微镜下活率能达到70%，可是贴壁率很低，是什么原因呢？冻存液用的是10%的dmso和90%的FBS;冻存时，细胞融合度大约在90%到99%之间，是不是融合度太高了，细胞老化的量已经多了。请高手指教，谢谢

tjutiger

复苏的存活率70%有些低，拿贴壁的就更少了。可能与你冻存的步骤，与复苏的步骤有关，基本原则是慢冻快苏。

hwlightning

10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培养基（我是用的低糖DMEM）" N$ W. J) w  @, }* ^+ T' n
4摄氏度放40分钟、零下20度放30分钟、再放零下80度、放24H就可以放液氮罐保存了
* K' v# r; M8 j. y- k一般就放-80度保存
/ K# I4 r" {) \9 m' Q' C  s如果有程序降温盒就省事了，直接零下80
1 g$ a9 Y% p1 @: P" J复苏效果很好
; G; F$ h: V  x: {# c/ w" z/ [冻存的细胞融合度80%左右吧！" ~. X5 s# }: m7 I) {3 ~; w7 E
如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四度冰箱，因为DMSO放热，刚加进去和容易损伤细胞，常温DMSO对细胞毒性也大。
# D- [' R. c% [/ p8 M复苏细胞我用的42度水浴，速度要快，不能有冰晶。
3 o& {% U. A" ?8 x. i6 x取细胞加入准备好的20ml培养基中，离心。重悬，培养5 A5 d+ s0 C. B1 ?5 j7 r
希望能对你有帮助

hwlightning

用完全培养基就是1:3:6

menghy

7 Z  C, D0 }, n% o% g8 ~5 S
/ x1 W7 e0 a! q+ l9 E楼主应将更详细的复苏步骤写出来更好分析一些。3楼的回复其实已经很详细了，我个人认为用10％的DMSO＋20－30％FBS＋培养基就可以达到很好的冻存效果，在复苏后效率也能达到85－90％了。为什么要用90％的FBS呢？还有就是在冻存的时候选取的细胞根据你培养的周期在对数生长期是最好的，细胞密度太大，就会发生接触性抑制，细胞停止了增殖，这个时候冻存的细胞复苏后效率就会降低。

andylee824

好的，谢谢各位楼主。你们提供的方法我都做个试验看看

andylee824

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# j. u% Q4 Z: K
3 n8 E5 T7 H5 T你说得复苏时，不能有冰晶，意思是在水浴锅中，细胞要完全快速融化吗？

hwlightning

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* L; R/ Y  m; E4 F/ W0 i8 W. l4 {. k4 A- o, K) y# h
要慢冻速溶

andylee824

  在水浴锅中,快速的晃动，是等全部融化了拿出来，还是有少量冰晶拿出来？
5 _/ _: |& F. Q& O" ~# t. J" v  楼主的意思就是等冻存管中全部变成液体了，再拿出，是吧？

wangyimei

" ]/ E1 p) j6 |; N
) ?6 L; I) T1 M* O3 P7 i7 U% A& D  l按照文献上说的都是细胞在复苏的时候，不需要等到培养液全部都融化，而是大部分细胞融化，有一些小冰晶的时候就可以了，然后吸出细胞到离心管的培养液中，然后离心，种到培养瓶中就可以了；第二天再换新鲜的培养液，以去除冻存液中残存的DMSO；: d: g' I+ R  j1 H4 W0 O8 c/ `- @- \
还有间充质干细胞在冻存的时候不用走4°，-20°的温度梯度，直接将冻存管中的细胞就棉花包好，直接放入-80°冰箱过夜，第二天放液氮中就可以了，复苏效率很高，至于冻存液中各种成分的比例可以用FBS:DMSO=9:1;也可以培养液：FBS:DMSO=5:4:1来冻存。