求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？

stefan

   求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？
7 A3 {1 O7 {- ~; a& H  1、近段时间准备对犬骨髓干细胞表型CD90/CD45作流式鉴定，但是无法买到抗犬的细胞表型抗体，想用人的抗体代替，不知道能不能行？有哪位大侠做过的指教指教？？* {7 \' M$ ]5 _' X+ \# N
  2、还有就是想请教有人用过eBioscience公司的流式细胞产品吗，不知道效果怎么样？
# I  F4 |0 s* t# S0 o  3、小弟刚开始做流式，这方面比较不熟悉，了解的朋友能否给个流式细胞细胞表型鉴定具体的实验步骤啊？越具体越好，这里先行谢过了！

wangzhiqi86

回复 stefan 的帖子/ C2 G# h! p- o, g3 _
* c4 o7 R5 _. t  s5 L  ]
抗犬的估计很难买，因为大多数都是抗人和抗鼠的，我当时买抗兔的也很难买到，建议你几个公司吧，millipore、AbD Serotec、Antigenix America、BD，这几个都不错，特别是Antigenix America的很多抗体都是别的公司没有的。: ~5 x3 V! z9 y! i; S" m
这是我做的具体步骤，你参考一下8 M$ B' Z! k  _& P
①P5×105 cells—1×106 cells/样
9 {# ]# ~: {; s( D: f7 H  V- v②抗体稀释液洗涤+ a4 f! e% t; N1 P2 |
③加入一抗，4℃避光孵育30min
8 P6 j* \0 y; J& I, m/ f④抗体稀释液洗涤
% I$ {% _) k  ?- Y0 v2 b1 L⑤加入二抗，常温避光孵育6 t$ y2 i7 Z, D& S% d
⑥抗体稀释液洗涤
1 ^& S5 j1 T  M! n, o* _⑦加入抗体保存液，4℃避光保存待测- _8 C) Y9 v# ?1 f
注：如果一抗自身带有抗体，那就不需要⑤、⑥步。

wangzhiqi86

回复 stefan 的帖子) `% h3 }, s( a

1 v' s; A* `, @7 j买抗人和抗鼠的，与犬有杂交的也行，但是交叉结合效率就不好说了

gact

看看基因序列，，，，

卡门

eBioscience公司的流式产品我们实验室也有很多人用，比起BD的要稍微差一点，但你需要检测的指标比较一般，没有特殊的要求或表达量很低，所以用他们公司的足够了。
% x  u! k% o9 H. d7 [2 I/ O/ v一般买的流式抗体都是一抗上带了荧光的，所以可以直接染，而且你要检测指标都是膜上的，步骤比较简单：
- T+ ]. U9 S! E/ k; N% W: V- C我们的染色步骤，供参考：$ T! u% @* ~3 h
   1x10*6---10*7的细胞用PBS洗涤，1500rpm  5min
% E4 [1 V2 q8 ?# h; ?, p- X# V4 D     去除上清，用PBS100-200ul重悬
& E0 g- I# m! I: s: a0 D6 l   加入流式抗体，根据说明书每个test的用量，其实可以稍微少加，有人用一半的量也能做出，但该开始的时候，还是按说明书来加; _! H, V! }  t4 U% z. Y
   4度避光孵育15-20min，加入1ML的PBS重悬、混匀
- b% y9 g1 s  \; y" `   1500rpm 5min离心，去除上清，重复2-3遍
% d, C& I5 z1 `  k4 g   最后去上清后用300ulPBS重悬，混匀后即可上机检测
/ R* g. p$ z; V  [5 `# tPS:染色过程中，注意尽量避光，及4度孵育的环境

ylj

这抗体是很少用，不过想提醒LZ，间充质鉴定光用以上两抗体是不成立的！+ R8 d9 R3 @  B& m: Z9 Y* W
流式表面抗体发育我们一般是：3 g2 o& d2 Y' _% u9 x
1、收集细胞，分装；& [: X( W0 _2 }7 a+ a/ U0 _
2、PBS洗两次，200G离心5min;# D3 J! K; b/ a7 t8 T* O+ _, b, o
3、50ul PBS重悬，加入相应抗体混匀，4°避光孵育半小时（10min混匀一次）；7 O, u7 _5 v5 ~! N, S% |5 `
4、取出加入1ml PBS洗两次；$ ~* i& S' ^% O
5、200ul PBS重悬后直接上机或1%多级甲醛固定后4°保存待检。