慢病毒包装质粒 能否共用？

刘森泉

向各位请教：慢病毒包装质粒是否能共用？我之前用公司买的慢病毒包装体系里面带的包装质粒包（pCMV-VSVG和8.91）慢病毒，不成功，但是我用了师姐的那三个包装质粒（PL1/2和VSVG）试了下，竟然包出来了。由于不是做分子这方面的不是很懂，想问下这到底取决于什么，只需要HIV病毒的几个部件齐全就可以包慢病毒吗？那到底怎么看呢？谢谢！

xiongjiedeng

  你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下7 b8 B0 j" K8 r% x
磷酸钙转染制备慢病毒
  s5 H3 f) x, X3 x4 _1、 试剂配制
: c3 o% ~* c- `5 o1.1  2×HBS（500ml体系）:" }' f6 ^4 |4 l6 u4 k7 {7 k
样品        浓度（mM／L）        质量(g)
1 F' o) m4 m& X( X( e8 NNaCl        280mM        8.18g
$ D2 |7 K; w! V. ~: ^1 {' S! d' _KCl        10mM        0.375g
: ~. p, Q) f6 V  H% RNa2HPO4          1.5mM        0.1g% I( I3 w) r$ h% v  ^
glucose        12mM        1.19g0 x( L" z0 t- c1 J  K
HEPES          50mM        5.95g6 T' U4 w' ?5 ^2 g) A
        配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌
  R) i7 l/ m. m; u; P        1.2  2M CaCl2    二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml7 P+ c3 @* F: g: J5 K( }
        2、转染步骤4 V& r5 ~: \5 _' X
        （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
/ B6 \% @. x( s （2）  将下列3种组分混匀1 D: a  k+ |0 B4 n# j$ S4 _
试剂        体质或质量$ G" y0 D5 t" {7 w5 T9 X- x
灭菌超纯水H2O        600ul# f( g) A8 v. V8 o$ P2 d0 f
Plasmid（质粒）& I9 Z: T, W  a; s/ `3 A) Q
（共270ul）        cDNA（目的质粒）          12ug8 U5 Q( |8 Q& D' p5 t; O* U- _
        delta 8.91（包装）        9ug* Q! y4 _( m% ?9 ~% `
        Pvsvg（保证）        6ug) E# l( l# g& p7 ~+ G
2M CaCl2        132ul
6 ~, [* l! e( P, o* D+ m        （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可& `% W' g; i: r& ]7 B5 C
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可

songyang1987

长知识啊

164ly

同问，可否共用？

刘森泉

xiongjiedeng，您好，太谢谢你了，你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过，没有问题，但是用感受态做大抽时经常提不出来，不知道何缘故，所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒，293T细胞，我相信包病毒过程没有问题，因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗？校对下。还有，你地点在哪？可以问你要点包装质粒或者菌吗？谢谢！

xiongjiedeng

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% q3 Z  D# z( A8 w6 f2 Y2 Y/ t
我们实验室用量比较大，包装质粒都是自己大提出来的，我在长沙，你呢？

刘森泉

谢谢！我在杭州，方便给我一点吗？

Sushi_Tuang

xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57
. t0 z0 |1 F6 _/ K. [  s你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质 ...

4 I- K4 o- P  H% D# f1 _- h
想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗？我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP，请问也可以用这个包装系统包出病毒么？期待您的回复。谢谢

细胞海洋

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chenhuachen

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！
$ O, T& H2 P0 a' b人的或者大鼠的野生型p53都可以。