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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下- y; W0 o, { G$ i: a. P. T; g; P
磷酸钙转染制备慢病毒
, E$ p* M! b; n) y h1、 试剂配制
# }) |4 r# a0 p) Y1.1 2×HBS（500ml体系）:
8 M: B: w! U% J! q样品 浓度（mM／L） 质量(g)3 @5 x$ D* c) E" ~! F T; {8 v o
NaCl 280mM 8.18g: o2 Z. t4 v3 l3 P. n% E6 r; m+ E
KCl 10mM 0.375g* y9 `9 N6 G! q. U9 z2 u( D2 I
Na2HPO4 1.5mM 0.1g
& @% a8 h/ D( H7 u& Sglucose 12mM 1.19g/ t0 d- H5 ^# H f: C# b
HEPES 50mM 5.95g
3 ~: x3 s* u! @% L 配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌
8 M' a0 l. o$ D+ J: b% p/ D, J M* E 1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml
6 q" \8 q- `4 q+ Q$ j3 s, C 2、转染步骤
6 T4 O$ S% b6 }1 C3 a7 ~6 {+ J2 G （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
, h* S+ U% X1 u* E3 _ （2） 将下列3种组分混匀
5 h0 F( _9 K+ X7 D5 \& g) N+ c试剂 体质或质量
' U2 I& \, D/ R灭菌超纯水H2O 600ul
: L# X6 D) H7 Q0 M. j# LPlasmid（质粒）
+ c+ `$ m- _, f0 i（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug1 A5 p! } f$ @7 ~" [
delta 8.91（包装） 9ug$ n$ ^* O1 c- O& T2 F# q9 j; \
Pvsvg（保证） 6ug) C' A" o8 M" \0 Z1 w/ ]% x% g2 g
2M CaCl2 132ul
1 P$ m) S. }. ]! }9 ?% @* Z' X （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可
& A- g: \* W9 `) l/ o3 r* s（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
