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[请教] PCR搞不定了,丢脸啊~请各位高人指教!     [复制链接]

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楼主
发表于 2012-3-25 01:42 |只看该作者 |正序浏览 |打印
这货叫做CAG promoter,俺是以质粒为模板P的,确定质粒是好的。序列如下:
  d, a) D( O: k) c. zattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa: x2 x& n4 K, e; g: ]$ |
引物:
+ M* w' ^: G3 }# i. z( k, wF:attgattattgactagttattaatag- k8 z  c' \8 r' T. q* Q8 N
R:tttgccaaaatgatgagacagcac
" [$ M1 c5 q' i* Z1 r# C7 kKOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带,只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的,说明体系本身东西都是好用的。
5 i0 o; w. i$ U0 C7 W: \我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%,但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO,或者提高Mg,或者提高退火温度or解链时间,或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了,没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了,借用宝地问问高手。' {* }4 g# {- P4 I) O
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发表于 2012-9-3 20:56 |只看该作者
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: i* ^) h- i" P5 w$ m
* Y- m0 Q) B8 f8 j7 g楼主,你好,我最近也在P这个头疼的CAG启动子,都试了好几次了都没搞定,可以把你的引物和使用的酶,以及设定的具体参数发给我不(or 我邮箱:zh_liao@163.com)???感激不尽呀~~~拜谢!!!!

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发表于 2012-3-29 12:41 |只看该作者
订了个长引物,同时用KOD-plus和KOD-FX,结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短,之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀~疑似软广告了啊~
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发表于 2012-3-27 06:49 |只看该作者
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加betaine 试试 68度多跑几圈 (比如60)
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发表于 2012-3-26 22:31 |只看该作者
回复 sykbod 的帖子' [. |! S: U' Z' x2 i

! S1 _+ q/ s4 v( ?引物已订。非常感谢您的热心帮助!

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发表于 2012-3-26 22:18 |只看该作者
回复 ying 的帖子
! L; @' C: T1 d8 m' e
* S% P& Y. o1 g: agenerally, if you have tried different annealing temperature and DMSO and it still not work. I prefer to design another pair of primer. You may want to use longer 5' primer.
1 N) z5 }3 k- m( h+ j0 Z) h
+ c4 c  T- t5 ~7 vGood luck.
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发表于 2012-3-26 21:39 |只看该作者
回复 hndxws 的帖子, \! j* N8 q# P" }9 K3 U' X1 r  I

6 C3 q; d) a; U( b+ G, x, B忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件(网页版),自从他毕业了我就自以为有经验了,就忘了他的宝典~今天算了算,果然只有41度多点儿啊~惭愧惭愧!被CG搞花了眼,搞错了主要矛盾啊~
, m5 k. T5 \8 ?2 S. t不过话说,有人用36度退火么~俺去试试~ 但估计也不行,这回就该CG捣乱了~不管了,试试再向大家汇报,当然,引物先订出去~

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发表于 2012-3-26 21:33 |只看该作者
回复 sj03572001 的帖子
! q  ^  }8 _3 J0 ~- c4 A3 n+ x& @' b, G; J6 g
此酶我们实验室还真有,可惜找遍冰箱,酶确实找到了,还不少,就是没有buffer。汗~

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发表于 2012-3-26 21:31 |只看该作者
回复 hndxws 的帖子
1 @( ]1 J0 b" P$ U) S0 B: ~- g2 D' A- j
多谢这位大神,至少现在我自己看来,可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度,退火温度梯度,Mg梯度,还换了个invitrogen的高CG酶,果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物,做完再向大家汇报!

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发表于 2012-3-26 15:38 |只看该作者
建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer,货号::DR044A,我去年扩一个基因遇到高GC的情况,普通的TAQ酶总是跳过高GC区(高GC区可以形成复杂的二级结构),或者在高GC区延伸终止,后来用TAKARA的这个酶,一次就搞定了
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