PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：
  d, a) D( O: k) c. zattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa: x2 x& n4 K, e; g: ]$ |
引物：
+ M* w' ^: G3 }# i. z( k, wF：attgattattgactagttattaatag- k8 z  c' \8 r' T. q* Q8 N
R：tttgccaaaatgatgagacagcac
" [$ M1 c5 q' i* Z1 r# C7 kKOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。
5 i0 o; w. i$ U0 C7 W: \我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。' {* }4 g# {- P4 I) O

leozarah

回复 ying 的帖子
: i* ^) h- i" P5 w$ m
* Y- m0 Q) B8 f8 j7 g楼主，你好，我最近也在P这个头疼的CAG启动子，都试了好几次了都没搞定，可以把你的引物和使用的酶，以及设定的具体参数发给我不（or 我邮箱：zh_liao@163.com）？？？感激不尽呀~~~拜谢!!!!

ying

订了个长引物，同时用KOD-plus和KOD-FX，结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短，之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀～疑似软广告了啊～

石山巨石

加betaine 试试 68度多跑几圈 (比如60)

ying

回复 sykbod 的帖子' [. |! S: U' Z' x2 i

! S1 _+ q/ s4 v( ?引物已订。非常感谢您的热心帮助！

sykbod

回复 ying 的帖子
! L; @' C: T1 d8 m' e
* S% P& Y. o1 g: agenerally, if you have tried different annealing temperature and DMSO and it still not work. I prefer to design another pair of primer. You may want to use longer 5' primer.
1 N) z5 }3 k- m( h+ j0 Z) h
+ c4 c  T- t5 ~7 vGood luck.

ying

回复 hndxws 的帖子, \! j* N8 q# P" }9 K3 U' X1 r  I

6 C3 q; d) a; U( b+ G, x, B忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件（网页版），自从他毕业了我就自以为有经验了，就忘了他的宝典～今天算了算，果然只有41度多点儿啊～惭愧惭愧！被CG搞花了眼，搞错了主要矛盾啊～
, m5 k. T5 \8 ?2 S. t不过话说，有人用36度退火么～俺去试试～ 但估计也不行，这回就该CG捣乱了～不管了，试试再向大家汇报，当然，引物先订出去～

ying

回复 sj03572001 的帖子
! q  ^  }8 _3 J0 ~- c4 A3 n+ x& @' b, G; J6 g
此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～

ying

回复 hndxws 的帖子
1 @( ]1 J0 b" P$ U) S0 B: ~- g2 D' A- j
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

sj03572001

建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer，货号：：DR044A，我去年扩一个基因遇到高GC的情况，普通的TAQ酶总是跳过高GC区（高GC区可以形成复杂的二级结构），或者在高GC区延伸终止，后来用TAKARA的这个酶，一次就搞定了