PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：# @5 n. ~% h$ \8 m' ]# s
attgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa, r( x9 j" w& p1 X; J+ K- X8 T2 ]
引物：9 P- ~0 K! {; ~. j8 d* T5 g: |  d% M
F：attgattattgactagttattaatag
  A0 O0 t3 l" u/ T* H5 z; Y, sR：tttgccaaaatgatgagacagcac! ^/ r1 l0 [. c! A- @3 ^- E
KOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。
+ K3 a6 w! r9 C2 G% I* p我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。5 q1 T6 f% X; G; ~

sykbod

手边没软件就没对你的引物，想来做了那么多引物应该没问题。$ k$ e1 k8 W2 i0 W/ S; L/ p
一般这种情况我加DMSO了 退火时间给1min2 X2 e& v: Y( S7 Z8 j( o' i  W
局部超过90%应该也会有条带不会很干净，除非你两个引物刚开始p就进入高CG区。不加DMSO的话曾经做出来过72度退火才有条带的（两步法很好用 真的）。加了之后减5-10度都可以。具体看模板了。" W7 x' |! y7 E! `- H
话说做一个梯度不就完事了

zxcv12345

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( ]% [! z) l% {1 T7 B2 g8 u$ Q$ g5 i; M( z0 L1 P
很正常的。# }# n8 R( d' h/ ~: m
) O: Z% x# p5 S$ z6 P9 }1 y2 i3 ~" e
promoter的GC含量高。DMSO条件可达20%。1 T+ }- b1 V6 T+ n# q/ n  w
1 a4 M+ \5 n* X; B/ F. [' [6 d
Takara也有专门针对高GC的试剂盒, 用起来还可以。
( r( U* ^. [% R& x8 e: {# S
4 L- _) J- N5 v另外，一定要确定质粒没问题。去年我PCR扩增质粒，做了一个月，什么条件都試了，最后测序发现对方给的质粒错了，

hndxws

上面几楼回复的都有道理，但是我个人觉得都不是出现这问题的重点，如果不信楼主可以按他们的建议试试，看是否会有改进。我觉得进你目前提供的信息，最可能出现问题的是你的引物。
; R* C, H! R6 L! G0 dPCR反应，如果实际都是好用的话，主要的就是模板和引物。在你这里主要是引物出问题了。具体来说是你forward的引物退火温度太低，我用软件看了一下，只有40度多一点，这样的引物在你的条件下是不太可能有条带的，而reverse引物的退火温度就可以。所以你的问题是引物不合适导致退火温度不合适，PCR不能有条带。
+ p4 {5 q$ t$ d1 U  Z我们很多同仁，都觉得PCR简单，但是真正对PCR条件有理解的却在少数，大家都是嚷着，引物长度多少到多少，退火温度什么加减5度，太机械，我从来没有按什么加减5度做实验。最主要的就是引物实际的退火温度。在你的引物里，第一个长度虽有26，但是退火温度还没达到你设定的条件，第二个虽然24但是已经达到你的退火条件，PCR退火条件同时也不能设太低，低于43度的话，会因自由能低，一样不成功。7 D& j$ S5 x- J. M, |
我的建议是把你的第一条引物换掉，在原有的基础上再加5个碱基，即attgattattgactagttattaatagtaatc，把退火温度设到55，一般的质粒模板，这个条件绝对没问题。你试试，希望把结果告诉大家。

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

ying

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% O, _) {$ g$ {# M5 S) P  v2 b
非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

hndxws

既然你要试，那你就试吧，长点经验也好。

sj03572001

建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer，货号：：DR044A，我去年扩一个基因遇到高GC的情况，普通的TAQ酶总是跳过高GC区（高GC区可以形成复杂的二级结构），或者在高GC区延伸终止，后来用TAKARA的这个酶，一次就搞定了

ying

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9 t+ G8 [# C. p6 B& a4 q4 p: {- \" z: F
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

ying

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$ x: o. l' H: h1 X9 c
2 X/ |, V+ ~; n6 y! a此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～