荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

& v3 b* ?- Y: V$ I
, B! u4 L9 J: s+ Q4 b
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？, [/ }0 e3 T1 n" r3 _( d1 @1 e+ a
2 i, h, t. {+ ^. @9 B- g- }# w3 Z
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。  M  H3 s6 p' C/ q4 Z0 C) D  [* S
不知道是否有探针数据库可以查询？
% W4 `. B. n: L6 T! Z0 _/ u5 X6 H% Z; W8 \+ H9 {5 }  m
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？: w& ?- P2 ^# P" ?" B+ ^/ T
6 ?+ P0 C' e8 {! s+ F+ \' {& Y
求高人指导~* ?0 u, {, B$ n2 W& S- s3 R' Y0 U

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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+ v  g- K+ w1 p( F) Z: v, o* B% [0 T; j4 j8 i3 D* ^
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

- ]2 M' k4 b% e% S$ R' F3 r- a$ H& u  s4 s2 Z( @
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。. L. Z- |" {* p: b4 s# |0 r& V+ i- F
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。0 J# K; ~4 J7 Y/ `3 X
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
. F0 Q6 _& _+ c; [$ {' x5 d7 D standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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3 e& L1 e$ M1 w4 m$ F" ~6 R& y0 E
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 4 B- G/ F+ A1 S1 r- ]
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

5 h. {" t( ?! s' I- ~, t* E
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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" E/ ?) S, _) c7 N/ z- h' C8 R) a/ R; E
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。9 J& i- `4 Q% E" R6 Y
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。. V$ D0 b/ P- ]) T3 w
几点注意：3 t  L5 \5 ]3 c# _# n! l3 a5 A
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
5 [! f; ^  V1 b8 A( F& t5 @2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
0 b: |1 y' `3 a3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
' ^, d6 e) j! M8 z6 v& w' u4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。2 _; y3 d+ C& n! j

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子* l& A/ I7 s1 W9 q

. E' {7 G2 D) p2 K1 [& u& q2 [第一次已经失败了啊，唉，呵呵