荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

6 ^$ O; A) [' I+ U
9 d6 F/ W+ s! Q% H
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？+ w( w/ p4 ^+ g9 W+ }

) G2 n- D5 p% H看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。. b8 F5 g/ R# p5 i: {
不知道是否有探针数据库可以查询？
  H" F( N  J' L9 [
8 \" ~, J' B5 r; G( o! S. m自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
$ ~* `" Z  |; c, K+ v" D& k; M. G0 j) I& L# f; Q  [: r9 V: J0 P. T
求高人指导~+ Y7 c4 c3 U6 R# _" }" I

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子- t9 y2 l7 M2 D. ^4 v4 b

( H3 B) |6 Z' i7 j& W可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

' {8 Z8 W1 _7 T6 l: p
/ u- t0 t# D; |* s' _  G8 S0 [; ]
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。6 m. I/ w5 {1 d" k' V' {, C% y
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。1 C4 j1 ]. q; }8 e+ k) E
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
: \. [- }+ K3 B1 [9 S standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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4 q& p' w& u& d, X6 M0 B3 M2 ?7 o, e' Z4 h, B
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 / [5 x! X2 J# \5 w2 x
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

. `# v7 i6 b" Q2 o3 E3 f1 c2 e
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子9 V" F+ m5 t. g3 d: d. k
5 r2 Y5 l' Z7 h3 E! ?
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
. \+ w, N" \9 ~6 e! {; TTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。# }6 q/ R' L: ~
几点注意：
3 N- e  w/ S2 q+ x7 b. O* m1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
. L7 a4 u0 e$ q6 p: [  q; Y2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。, Y- g, {( X( c( G
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。- w! q; w2 O* ]" C" C
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。
- `/ v: w1 G! m  @; U4 t

l19rna

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" W# L% z( T# e
: p  N( g7 G" o) e9 h7 }第一次已经失败了啊，唉，呵呵