荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

3 O4 k. ]; @/ k
8 [( P3 ]2 N6 g
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
8 v: n/ w/ A; P8 q0 k
+ Z& @4 T+ j# V6 |看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。7 l! `. k- m9 z) l1 k
不知道是否有探针数据库可以查询？
: j' m* N0 M2 F. d  p# K* R; [
: y1 U$ p  \3 T& u* B  n% r自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？. H) n: e; t- f* Y

+ b  V' S, G, T8 K* D求高人指导~: c/ b5 v. ^/ }/ w# s1 b7 q2 D. v

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子( `, r  b- R+ y: l& E- s

% F- K, p; P2 S! h可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

! i" o2 v2 L* H3 J5 E; i! X: B9 V! J. |* k
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
. a  m5 o' x# `4 K用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。  g& e5 X9 D5 s& `2 N
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
. j4 Z8 \! H/ Y  \ standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子4 |" E1 V: z! C* _5 J. d

$ U( z" }4 p; b! Q8 a5 L果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 ( U# k' Q1 E/ E+ d  W
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

" L) B+ K1 z4 t7 M' w( P附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子% c8 T; Z- z- j. A4 S
! W. X6 W" Y5 l, `1 S
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。  V( W( {% ?0 s5 d$ @+ @
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
4 b# P1 H- ?" Y8 s几点注意：
" ]0 [. i* r4 ^, k" ^4 H" I, o1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
) F7 }; y; i) T3 ?, Z* \2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
  M1 a9 q4 b# k9 S, Q3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。: `3 V) w, v, P
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。
$ z) w9 Q' l3 Z& Y* ]# I

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子  G3 E8 A( E. B: A. P; U
  `4 W2 c$ E* X/ R$ r& j4 L# t
第一次已经失败了啊，唉，呵呵