荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

8 U8 i0 n$ a& V. D0 X

0 j: ^3 R8 L8 T& x4 v# J最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？' X& i$ N/ b/ |. }! d& u& `
' h! v8 S7 L8 F% I0 l; K& h& e* ?, }% R+ Z
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。& \9 ?/ X5 v8 z/ d, \- N
不知道是否有探针数据库可以查询？
4 W5 V5 L& f5 K, ^/ B
- L0 a; _7 a3 l, M7 ]% }8 z自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
6 A) |! l- q1 K( T# n8 m, z. G* D/ n+ W( S$ B( ~" v& B# w
求高人指导~) m) q, v/ ]4 {/ ^+ W

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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( D5 R1 T! S+ J
' a% s3 |$ K: _! i3 g3 b9 _0 B可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

& {9 J% Q9 m+ d. ?! v/ n6 {3 z' {. C/ c
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。1 g2 c) X, n+ X; o3 d) N$ J
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。7 n+ N, n* D6 H* t+ ]
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。5 Z# s3 ^9 x0 R) ?& g
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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' T8 K- n- N/ c& R, [
# i  h% P0 w; m3 @果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 8 ^' K! c/ u% O! I
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

2 F2 k( [! _4 J" ^  A( O7 T# D
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子; D6 p# M1 x2 Y' {! ^
5 v( O; x) k2 ]( {
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
5 l  s9 D; ]- o- ETA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。2 r8 s! c8 d& S
几点注意：
) P7 g% I! `9 C0 a* {; I1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
4 a/ ?3 M% D' z* V+ i2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。" b8 M* _, |4 C% r  g
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。: U. Q- w' {4 c1 ?0 X. Y/ X
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。. }1 E! {, y- [% Y9 h3 W

l19rna

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, E- R" C$ t) L- o8 m- m$ r
第一次已经失败了啊，唉，呵呵