荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

: ?2 m2 N8 k, j5 ~, ~: u
2 U9 v& }5 x" [( N* U8 D* v- [( M5 y最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？4 z+ i, }0 y" \2 u( [8 `5 A; ]
9 \' \& ]1 X& @9 u( Y1 q3 M4 o2 f
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。; i+ ~1 v5 v! K
不知道是否有探针数据库可以查询？
' C& d0 C; y& k4 G  u
. e( R6 T* P- K' m4 T自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？) G! d/ |" _( i3 J, J. C& B

+ V, _: g7 w& f8 M- M" F* G求高人指导~
: \- v$ D9 ?2 I% T2 h% _$ G$ y9 }2 j+ T

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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* ^9 s. h' X, A8 v8 D! A: Q$ L/ e2 [可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

2 [7 J/ P6 J: K, [) G+ S, d5 |4 L( Q" ^# D+ G# G( _
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
% K! q, M+ F, l# q" V/ ?% M7 `# s& Z+ m1 e用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
/ S& C% U& V* ?5 q4 }( t& Z上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
* d, g% E' A7 m0 a$ A' L standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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& v4 l- @* C- I: s% s" P* _
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 2 L# x4 Q" d- R  F& A/ M9 }- K. Z3 c7 X
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

3 w- d% R2 w9 b, z/ O) c  [7 H
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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9 G! F" P( o% Q4 s; x
1 z) H5 R* q% n/ y) e0 r% V参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。3 `# w) [; q' h7 F, {# @1 R4 Y. g
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。/ y) x" l( Y& q
几点注意：
5 o4 H( k* E7 I$ U+ S  i1 ]1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。9 f- k3 n# m+ b: M1 C, ?
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
! @! O% T6 j; S( B3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
( V1 c* F& B) z/ _8 B) Z4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。
. s: s1 |( Q/ G! w  D

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子) k0 j2 q% g% @7 D& C0 f. X( T+ U
! m' p. S& I7 u) g! w# h! ~
第一次已经失败了啊，唉，呵呵