荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

# a) ^  i. {9 U! r" v# d8 _
8 \( v: f5 v8 \' r5 V最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？- N$ _3 l( R' l5 `. ?" D% j$ U
4 o9 c' [1 x3 t  W/ s
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。. k9 d% U0 a* C; g
不知道是否有探针数据库可以查询？
  m4 S- x( `: l0 B! L- G! q! b) U
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
- s- J$ j& Q$ i. m4 b% k: ^# i% W0 S( x2 r; H' N2 B9 J0 w
求高人指导~
9 L1 `5 H, m- y3 L# M& R/ j

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子5 y/ L% a- q1 Z' j

* l# Z; S5 P+ z+ k9 ~2 n可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

% I+ k, ]) m4 f1 \
4 y# M8 N- c) ~- c. F! s# r* t* k
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
$ ?9 y0 E. [8 W1 J! A* d% R用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
, t! L2 r6 ]. I0 j上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
8 J' [- f( n& E& h6 z8 `4 D. J standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子
) X% t" @/ s1 h2 K- {! \) y- e( _, S& A% b7 K% ], n
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 1 m7 M8 R2 z. c8 k: _6 h8 O7 p
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

+ h1 q& v% K/ @0 J* c* \2 |附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子0 c% L+ z. i3 P8 O2 Z

. G8 ?% y2 g" @: g3 x) B" w参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。2 L" ~7 A; c4 m9 t: N$ ?8 V
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
6 V$ X; V# m$ S$ \* S! X! o几点注意：
% j' _! s5 g  f- Q: @: X1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
! c4 p- ?) M+ [4 ]- Y( a2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。; Z8 V' C! U7 Q8 g/ J7 t9 P# |% F* T
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。- A: ^8 N& J* e  [
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。( W6 j* B2 ]$ H; m3 \2 \8 z

l19rna

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7 ?' J, o2 ?, C  {/ v5 \7 c- {# U& \( U& t% @
第一次已经失败了啊，唉，呵呵