荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

' m' `2 t, `# [3 Z% k7 i

5 J9 `( O- H0 }5 b5 S0 E! h最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？  s! |% Q5 S9 B% R+ z6 I

* x8 ^" m4 T- S* Z" l9 l3 Z6 F看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。7 }$ {* W# @6 `% f( V: H8 `( Y
不知道是否有探针数据库可以查询？0 ?& m% P  x: [$ D4 N5 Y, y# {7 e

" T# M' p, Z& n& i* E9 C自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？' ^6 n- {: r( k6 \6 B8 _
7 N, m( v1 J; U
求高人指导~
" `0 H. ^9 x+ f. u

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子
, _6 r3 n5 e3 U! h+ j) p. e% g6 }" X8 ~
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

7 y  B' ~6 o- B7 U3 b3 n
& @6 i( b. U: B+ `7 f4 ~如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
# l: s0 M8 c1 e5 l. s" ~/ H3 r# r  R用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。7 ~4 k3 ]' z0 T0 O
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。% n5 H, V: z& P. M, N: q' m, g
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子1 t6 b5 d' J# U8 Q: F+ D

! ?4 t  W7 _7 l- p果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 ) k3 X3 F7 L6 F8 [( N
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

( U& ^) Z- x% Z9 S附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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' A8 T9 P0 y1 o" K6 |! M) d
. ^2 Q. n0 `+ ?3 o+ `& h* \0 c& W参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。% R) O, ~! f1 o
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
6 C9 m. }$ p2 D' F1 s2 M9 a几点注意：& W3 \6 j; i% J# D  p
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
6 g7 c/ h& n! ^0 s2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。" S$ l1 T; p8 i* N
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。0 Y" k/ x: a  M6 E- N# t
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。* }. V; K& C4 ]' K2 a* G

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子0 S5 B/ @* E' Z' x/ m
* g: T( t5 v7 Q& i
第一次已经失败了啊，唉，呵呵