荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

( M$ N! q7 P$ D6 U0 z* L2 v; Y& a; n" K4 I5 s7 l1 r$ g
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？* B( }/ G, ~8 l- c1 W
8 m& p" D0 J6 R. b( C( H4 }
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。: _) b, z9 b2 `0 f9 H6 p; i
不知道是否有探针数据库可以查询？
/ @9 X7 s3 s( w( j! u* \) C# N- U. m! c, X- ^* P
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
1 }9 G4 Y# Z$ i/ O% f4 F& q9 H# J3 p  w/ U5 D$ I
求高人指导~1 g% N% d" ]* D/ e) d" c8 ?, \; x

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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) d% W3 H8 w4 ~- p7 }9 i# R1 u
$ h/ `- _" `0 f' f- Y# {可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

. s& w' w# @9 y+ [& c
" h& ]  a! r" g& d" N3 J如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。% y* e8 O: Y) k& t1 {- l, P
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。! W) b& M  \& @7 d4 Q3 E6 Y
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。. h1 ?" B5 e! U. C7 r3 T
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子6 K( \$ c7 O3 c. f& J

  X' ^) d- s& ~# h+ H$ \果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
" i+ I# s0 S3 E7 o如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

! b% i" c6 ~% l$ m: R附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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7 H1 @, c. ^6 [$ |# O' z( D+ w% t& j) O3 R$ m* K- P
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。/ Y+ v0 R, t( O3 J" q" T
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
& F4 U: A' _& c2 N  a( e' n几点注意：
$ a' |0 T0 x4 V, M7 F1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。2 y- A9 F" H9 q% K" g
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。9 v8 [. K6 }3 \. I6 V
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。/ z8 F) D% m# C! m/ R7 _3 f
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。, v- H1 v5 J6 j7 B

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子% D0 h$ d" a3 E# u! Z% K; `
9 e% k2 t/ z6 t$ o6 t
第一次已经失败了啊，唉，呵呵