荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

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3 @; D2 t3 N) V) |4 h4 b3 J  z最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？2 |  l' N% q* f2 F" D
8 H4 j: }$ g/ f# J( Q) Q
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
' y; D$ B- E* M不知道是否有探针数据库可以查询？
% V3 D! j; O. V; @1 p: R# ^! L0 y: ~0 s$ ~5 D2 E: ], a! p4 q5 C
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？& j& D- @7 F' K5 v. Z

) ?- J' t, x* t7 z求高人指导~
& l1 w5 g, m. o+ V* S/ s

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子: i. W8 O, Y0 O5 n7 s0 F5 a
: o( _. E% A! q: A( r/ ?# |
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

" B% W4 Y/ U- j( `" A% W( q8 {; Q$ L6 b" X7 Q- G4 {; x( }
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。1 S; n1 |3 ~$ n. i. j, i2 s: m- M' ?4 {
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
; R8 B3 X2 [/ l9 N5 F上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。" y9 g4 @& o/ I6 P$ X3 N1 ]
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子
4 V+ [( p3 U0 E7 m& |" b' J; n. g$ Q- t2 \
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
" X! d- _# j: X如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

2 M3 }2 F( t# B  |( e) E$ W
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子4 S% m+ J: D7 D  a: f

1 W; Z4 [  f5 d7 I2 \) J! Q参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。& e: [6 t: x) g4 \" C# h
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
6 w2 H' r( l- H! w几点注意：
/ _1 S$ J8 n( ]2 R0 k4 x* M1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。7 D5 O$ L2 F+ |* K
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。5 S, l5 I3 r0 {% o$ E
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
4 I2 y  X* b5 C+ Z& ~( ^4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。( q/ i+ c. f  L; b& D

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子2 ]* C2 u% i) W

3 a8 a) f' }2 D, }' i. r第一次已经失败了啊，唉，呵呵