泪奔，细胞还没是没有长出来！！求前辈指点啊！！！

sunflower636

    在实验室折腾了两个月细胞还没有养出来，真是相当的郁闷。现把我的试验步骤列出来，望各位战友指点迷津。
$ [6 q9 g  n1 h. d1.无菌瓶收集手术中的脂肪，一般在20ml左右，最多50ml,迅速拿回实验室（有时候由于各种原因会耽误几个小时，不知道这样会不会有影响？）
1 S* o( z6 F, y$ Z1 H8 |2.在超净台中用加双抗的PBS反复清洗脂肪，一般到液体清凉就不洗了。% M5 M% {/ l4 m
3.剪碎。用组织剪剪碎脂肪，并剔掉一些大的结缔组织，剪到米粒状大小。
0 y$ p% h( G. d$ _1 e6 o) J4.消化。加入等体积一型胶原酶，190转，37度恒温摇床消化1个小时左右，直到成糊状。3 }0 O/ W1 b! `, m. v
5.离心，1300转离心10分钟。7 g% G% u. t- r8 }# u
6.裂解，轻轻倒掉离心后的上清（上层的油总会残留一些，不知道这里各位战友有没有好点的办法。）加入红细胞裂解液，室温10分钟。
4 ]" u4 t; n! m7 p  F" {) F7.离心，再离心1300转，10分钟。# q+ }% k7 Z' e2 ?6 N
8，加含10%胎牛血清的DMEM:F12，吹打，制成细胞悬液。
7 u" l+ T) Y. m- b' w) c. p0 e9.接种。将细胞悬液接种于用基质胶铺板的培养瓶。
8 ~# a7 d9 V4 n3 \. V' E3 ]( l" X& B- Q8 p: {1 _6 t
, d/ i+ f) h! ?; s' X3 q) ]
以上就是我的试验步骤，但是做了很多次，不知道为什么都没有脂肪干细胞的生长。不知 道问题在哪里，离心速度不对？还是试剂质量不行？我用的是GIBCO干粉配制的培养基，血清是HYCLONE的。胶原酶是sigma的，问题究竟是出在哪里呢？望各位战友指点啊。多谢了。

Tim

回复 sunflower636 的帖子$ q8 e( q# e/ D. ~& ]7 }( x; C9 @

! J5 I9 {" [  P离心的转速比较高！时间比较长

sunflower636

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' [% z$ B* d2 |8 U/ ?7 ?9 s+ q8 ]
: X3 Y! S$ G9 O那一般用多大速度离心合适呢？1000转？5分钟吗？但是这样我也试过，但是离心管底没有看到细胞沉淀啊。

evial

' x' B) {6 l& y) d+ \) P' t$ @
# _! U+ v1 i" @5 v" x你要190太快了，细胞都摇碎了，你当要细菌啊！

loyal

300g，3min

evial

9 m$ a. q0 h! J5 K! Y) D" N; |2 J
! w+ z& Y# v+ ?
小于2000转对细胞都是安全的，不同离心机轴不一样转速就没有可比性，一般用G来统一，有时300g相当于1200-1300转。细胞小的话离心时间长一点最长的15分钟也没有问题，一般5分钟可以把细胞离心下来。所以你的离心参数没有问题。
) ^5 V* _% D2 @2 L4 M# M- n你的第五步，加过什么东西然后离心么？

sunflower636

回复 evial 的帖子# M0 o  \7 `! W/ Q" T+ b7 M
' s+ [4 |( O4 }/ x: f2 z# Y. v
没有，我看消化成糊状就直接用离心机离心了。有的说要加血清终止消化，但是我查文献其实血清终止不了胶原酶的消化作用就直接没有加，离心了。

sunflower636

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; A( N' ~' d" @/ {- e& @
% w9 k: w7 n# X# }( ]# w+ o是吗？那你们都用的是多少转呢？文献里这是正常范围啊。最高还200

sunflower636

回复 loyal 的帖子. f# `$ @/ |* p1 g3 h  O

0 i6 J" X, B4 k* d/ V- Z, z3分钟？？？会有细胞沉淀下来吗？

stemcellmeng

这个一开始胶原酶消化的时候，其实放在37℃的恒温培养箱中，过个5分钟点到几次就可以，一般这样就可以把细胞消化下来，不需要摇成糊状。应该是你能看到脂肪细胞消化完之后仍然留在上层，但是在下层会有ADMSC的沉淀，这样就可以了。离心的话一般800g即可。还有，你的脂肪的来源部位也有关系，一般是腹部皮下脂肪或者抽脂手术的好一些~