切质粒时的浓度

mhqh

我用限制性内切酶切质粒，1mL的反应体系（总体积1mL，含酶、buffer、质粒和水），我切200μg的质粒DNA，这浓度是高了还是低了还是刚好？
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& w" F  W+ o" n. o! e! G4 x; G9 J另外，送的buffer好少好少啊，4,000 U 的酶（15 U/μl ），才送我500μL的buffer，那些buffer有叫10×H的，有叫10×M的，有叫10×K的，是不是可以稀释10倍用？是要刚刚好稀释10倍，还是要小于或等于10倍？

SSRSQ

你要用这么多的质粒干什么啊，一次切200微克。1000微升的体系切200微克浓度有点高，可以37度过夜。带的buffer很多的啊，10*就是10微升体系加一微升buffer，1ml反应体系才用100微升的buffer，通常buffer是用不完的。

86964109

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* P( i# z0 F3 ?) u" p3 A太夸张了吧 ，50μl体系一次切2μg足够了，2种酶各2.5μl，你用的是TAKARA的酶吧，10×H，10×M，10×K，是分别对应不同酶的需要的，分别对应不同盐浓度，一般什么颜色盖子的酶就用什么样色盖子的buffer，双酶切得看说明书或他们家产品目录上内切酶介绍选择共用buffer，打个比方如果你切50μl体系，那么除了质粒，酶 就加5μl 10*buffer，其余用水补

huangcong1988

你的体系是1ml？太吓人了，一般做酶切的话，体系是20μl吧？干嘛切这么多啊？我们20μl体系的话，浓度为1000ng每μl的质粒加1到2μl，然后酶加1μl（双酶切的话，一种酶加1μl），然后buffer加2μl，还有这个buffer要注意咯，buffer必须是两种酶活性最强时候用的buffer，其余的用水补足到20μl

zhangtcm

回复 mhqh 的帖子8 h, V; o2 b7 {6 Q. N( m

4 i& ^, S) L2 K- j1mL的反应体系，太夸张了，改一下吧。

zhangtcm

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. P. ?& Z: I& [/ T# Y, t+ C- t9 O& {4 \
给你参考一下
3 v* I) E. h! V& Q5 @& e2 |% H/ O5 B6 m
DNA分子的限制性内切酶消化2 c/ c# b; ?$ d% J+ o5 a8 [4 Q

3 k- x$ O2 l% d; p) p7 F3 f! z限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。
) |4 |, V; S! k1 d* [% t一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案
% y. q% w; G# M1 I1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
7 p3 H/ \5 D9 _/ t3 a$ U! f( m+ k& K2.20μl体积反应体系如下： 7 S1 `8 c# }% o" y5 }; D' ^, |
DNA 0.2-1 μg
. O8 T, J/ L/ b8 v. I+ @3 X: C$ E10×酶切buffer 2.0 μl8 n6 Z$ F- x2 w' s5 L) K
限制性内切酶 1-2 u（单位）
* g- h' U9 H7 o加ddH2O 至 20 μl) ?' U# d' ~  d% d) K  F( o
限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。
" ?0 n" h1 o6 t# b& D3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。  W' n% u, j) ?. A
4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
* ]0 H6 j& W; h  H1 r( e5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。
* |# D, G7 y1 N# n* V6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。
% @/ S: f, t; u, `7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。2 {& J4 [! s# h+ m1 g& Q/ n
二、电泳检测0 r8 ~& h$ N2 U9 {5 c3 G
取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 2 i) V6 b! Z2 p. ?' F8 b
三、注意事项' B- t# Z1 c4 m' N, ?. Y0 t
1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。
0 i. {2 W. F6 V" K- U7 g2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
' E- v1 R- ^+ ?2 s3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
) E+ X) F, m, s* r. L* n& D$ @9 T4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。$ {3 k/ A# _4 T+ P
5.注意星号酶切活力。
4 P% c1 o9 Y; ?: S

mhqh

楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
, t$ S+ e7 r! w  F# k! @# O) J* @, N: x8 v% z  c  v. J
我要一次性切200μgDNA，总体积是多少mL比较合适？
: E5 B) X) t" C( a* s
9 r. d& D; o& G# @" U（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

: z6 Z" E: m4 P2 d3 [1 k

+ U" ~  u% @4 V( }/ l/ N楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
: G6 X+ V) r9 g5 ]7 m% x
6 ~3 _, H5 ]4 L- w. G& V, r我要一次性切 0.5～2.5 mg（毫克）DNA，总体积是多少mL比较合适？% v0 J! w7 G, ^& c! y8 X$ k7 v& `: _

* i' u! E2 u3 a) o（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

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. |1 k' ?' Q# a( G2 m8 c# t) H7 P1 ?
非常感谢你！ 但是我想要一次切200～2500μg（就是0.2～2.5mg）。所以问问切的浓度

mhqh

回复 86964109 的帖子8 M7 v: K) x9 H& u" J" `- W

: c; y8 ~, w9 }* ?1 l7 Y- v* I/ z我要一次切0.5~2.5mg（毫克）