分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
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HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：; Z8 E( v8 K" J: l

  h  ^( w2 @* f& N. D! k1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
/ m4 v/ J6 K# ]: Z& @( ^6 ~. g! ?. z) a, ?" ~( B
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
. m/ G- k  p, {1 q6 r+ f6 K+ S$ p+ l; l3 n2 x, x, y5 L0 t
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
) R5 T; _' t+ z2 S& D- q" H& ?+ K" K& K& Q) K
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
- k1 r4 w* z- X3 ?
/ e3 U. N: e- k) A( S* k5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；3 ]/ ~  k# v( k  t3 `7 v" }- y) L
0 [' d# H7 A$ o/ t! r8 F
6、1600rpm（440g/min），30min离心；( K9 x- f+ L# S8 i0 M6 e, {

3 f# u8 R( O4 K/ W# Q" U% H7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；: ]# M3 p# l  K8 g9 z8 l+ G' s. ?
5 Z$ r0 p1 a( F' O4 ^
8、1300rpm（290g/min），10min离心；
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9、同样方法再次洗涤。) y2 Q  k5 ~, I  w2 ?$ |
0 @' [: A+ ]& ]( Y$ W5 C4 s5 }1 m3 x

pengxuleo

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9 }# n" F# a0 f( e- |" ?% e& B- ~* r" w7 E
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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2 x3 W. M+ P8 L  w7 P不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子9 G/ Q. e' t6 z* w; l3 A
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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

回复 gengtongyu521 的帖子7 p3 a3 ?* F- m
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多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

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% H: }- h& z& d. t) y+ B
2 `3 X, w+ ~  i" m; c5 ?6 P你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来