分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
% _9 E& Z/ ~9 i) Y9 ^

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：2 T; \+ P, e! V& B* i3 R. u; x( O
* M  }* z1 U- z+ v: r
1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
5 A7 `: W- m: x3 T! B2 B8 V' D" {* @4 J6 U$ K& X5 Z
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
4 f2 P8 V3 g0 L" O) z/ x
. S8 Q2 W6 x3 r3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；4 w/ c0 p! G! B+ l9 i# X3 N. D/ Y
6 ^0 v. p" X+ k! u9 u/ x5 d
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；" y1 H) m2 _/ J

; j* M" S- x" @2 I# N5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；
4 N2 `" h+ t/ e! Z- l" V- H4 ?  @; ~5 l2 K; p. C' t
6、1600rpm（440g/min），30min离心；8 b+ u& {* u( d( E6 Z# L! [; u* j

/ s# q& F" T! H! s! e, `7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；. |! [0 M5 f0 j& Y! K
, W; c  N( G0 S6 k. X3 E3 P  V
8、1300rpm（290g/min），10min离心；
4 N$ g2 H7 A5 s6 w2 }9 b/ E2 h7 g+ G2 g3 |3 y
9、同样方法再次洗涤。
( M! h6 ^8 K) Y* N
' s$ A8 s: j5 g$ S4 k" j) D

pengxuleo

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: w6 g  j9 W* S' O
9 q! }& g) E0 V不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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# @; D: D( x4 E, F- o! E  {! z, K3 q6 c) p" A+ ]
多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子+ z& L$ A' H: }- G4 S$ f
* ]9 s2 `' W4 X( ]; ?( S1 j
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来