脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
* q" v$ W" n; E$ v8 ~剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。3 k+ J& @( w5 D4 M
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
7 u6 C! I5 U2 B1 U  R) w+ _! j# ]5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。  w" f, Y, L, l) ~* K8 Z1 ]8 a
以上是我的组织块贴壁法，请教：# J+ }( o! p, V
①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？4 E4 N1 \. Q  v7 Q5 }3 r1 ]; g
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?- x8 i- _& P0 N( G& J7 i7 o( C9 t
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。* g; k/ i' s  y1 N% a
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
+ B1 s- ^) y3 _8 U  v7 O9 [# K( m用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,* n8 S; b' K9 C( r7 A
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

7 p7 P" S# ]% n  G: d! z/ p/ J
0 {  @6 S2 ~0 j. P2 X回复 老姜 的帖子
  e( a: ?9 _' E! @% D
- V, q. i" a# G/ U2 i6 R. y; j8 I! E$ H8 [7 S, u; l7 ?- Y5 G
这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
1 _7 }0 {. _% [9 u' B+ G需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。
% N  p7 _/ {/ t! y* Z离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43
( W. T8 B2 G7 R8 n8 O4 I: o0 n回复 老姜 的帖子

0 k5 h% \/ q, `/ b% @) @
你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
( ~+ E: |1 ^, W$ b) ?! b5 ]先剪成条儿，再剪成小块儿
; |3 w0 L5 d0 h3 [) t/ o$ o要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起9 Q2 S4 W- e+ H
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子
" s4 ?# Q: A  Z+ q2 P2 L
) r; ?$ \$ W* y! Q/ |/ i1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。' r* U7 z$ F4 q# R9 @! b# d
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。
7 z( V: w0 B' L9 R5 \  H3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）& L6 P! w3 B8 M, G5 J- }$ U" ?
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
0 s# C/ L1 o- f: [  }供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子
: k7 w  F3 l+ m% F, i" r- @" Y9 S& W% S6 Z
需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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回复 dongxin 的帖子! E- }$ S# j  J( u' L( E0 ^
& h3 P% @) J' q. f
谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！