脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

1 L9 L) I7 i) w- k
3 F% L) n' c& \+ F$ p将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
' V0 I" _% P8 g- @/ H; _: s5 o. D9 o剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。9 b( j" U' G3 G
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
! _; e, m2 T/ f( `& E2 n5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。* U8 Y2 D" O* d& [" d  U6 C) w
以上是我的组织块贴壁法，请教：  }1 k* o( E7 V3 G8 P+ z" E# R
①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？1 d' S; r& x7 r( C' N' Z1 v% W$ t
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?( ?7 j0 o/ P" {2 P) f3 m
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。4 V, M+ [! b- p# b! @
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
6 w% ~" |3 n6 }  Z用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
- Z% K% R) y' r9 \3 Y. S. t' J3 S, @% C以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

chslyx

回复 老姜 的帖子
4 t) A8 C% |, s& S' K* S' e+ u7 H$ i" ~+ A/ w8 b
请问一下是不是只去掉了动静脉就可以了？脐带表皮要去掉吗？

pcljsw2008

提提我的看法，第一，组织块太大了，而且密度太高，应该让组织块均匀分布在里面，互相不粘连，第二，楼主剥胶时间太长了，一般我操作只需要十五分钟，之后就是剪了，第三，组织块剪碎之后不用离心，要是脏的话离心一遍足够了，用生理盐水，不用用dpbs

yaoting111

接的太密了，让组织块均匀分布

weijunning

回复 湖南干细胞 的帖子
' O3 B$ S' a  G% j9 q$ G5 q% |: [5 m: E
污染了

weijunning

回复 湖南干细胞 的帖子
. B* n: |  N/ r7 u" _, J! T' v  g7 Y9 R/ K5 }+ }2 v
你这样铺组织太密了，但是应该不会影响细胞爬出，大概在5天左右。下次组织块之间间隔大约0.5cm，留有空隙可以更有利于细胞爬出。

2013sp

回复 老姜 的帖子
3 P; \" |9 b; g! F" g6 ]5 q+ A- `0 S
. q2 h& i4 S/ Q前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。2 Q4 _8 z4 u3 S5 q$ `3 A3 a4 V
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
7 `+ y  T: Z& P! C2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
# Y4 Z, P) G" U- z" j  U3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
( C! H1 B  M3 g$ a4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。# c* e9 `- u! F' i* M; d/ h
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。# z( v5 C% H1 h3 \  r5 ?9 k
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。& v1 {) H+ N& Y8 c
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。! s1 H* _) P; H, M; \/ g
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）  S, ]9 G/ G( v3 [) W8 Z& {; p7 }" k
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。! P5 Z4 h* d1 N/ V+ ]% C9 `
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 单个核细胞 的帖子# Q& L2 |! O  n+ n* k% c

/ ~4 f" O9 k! f; _/ Y, t# u前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。) d0 P% k+ M. q- |& p, a" B
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
. F. z5 X- O$ D* Z- b2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        / I1 R6 C7 R$ z
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
" H: Z! r4 D' p# q$ q- J4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
% S* J8 F8 @: F1 }5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
8 c1 l6 L/ j- T$ N8 h6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。- h" B7 k1 C1 @; w6 W7 j' u8 M
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
# c' r8 g% \8 n$ J8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）: ^  h0 u7 c% \9 Q, E/ G7 c& Y  L
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
8 h% T, b' e3 E1 ~7 R! A" W10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 湖南干细胞 的帖子$ m$ t" V; s7 [" w2 X
* S2 @4 P3 M. H, `: |
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
5 {. C: U! W+ e  t- x1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。$ ~# n. x' O0 S! X8 }4 b- s
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        & E0 [, m* m1 j7 I0 t
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。8 Z0 g7 x7 J, j! P, _. v) m7 h( e
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
' ^8 |# ]5 h9 R% m0 o- L8 q( H/ s5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
# [" }& I1 f% R, w5 U; r& C, F6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。* ~9 v2 F- ]1 \# G* T
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
5 n2 t2 V8 j% I; x4 ~# M0 x8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
) h6 ~3 a+ s$ T/ N9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。. h/ d  H# J! W  O5 t
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 单个核细胞 的帖子
" c/ s/ @4 D5 v5 c6 K7 {  y. `3 A; t
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
" P/ b( k, J# Z3 p. M6 P9 D- K1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。. {& s- J+ q8 K
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        9 j8 g* c  H- o$ c& e
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
; ~' S& L6 c2 ^4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。  Q0 t1 f- ]; ^) x3 l  F
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。( B1 k6 p' D4 N* C( ^) E8 h
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
( S1 t3 w- n7 D+ m& h; y7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。3 m$ H0 X4 A3 |8 v- }2 N& U# h
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）  h* n4 V  I& Z
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
6 M) [5 j2 z3 p. w10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。% \; \" c& b) T4 b* h  K( e
11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次