脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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; H1 h3 ~8 E4 f7 l将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。3 ]: ~4 J. F4 T1 P: w, \, U, r% Q, i
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。
2 `  L( T$ H7 p' {+ s4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
( f9 T! C! v' e0 `5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。4 p* y' Q9 d3 J& Z4 I+ }9 K) D
以上是我的组织块贴壁法，请教：
$ F7 r7 F% {$ C9 v( b8 ?5 b①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
& u8 i( f1 Z  q8 [②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
4 H# M3 Y) O$ [6 R- B: H③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。' |. t3 v2 u5 h+ |9 j
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
# p, u. \5 o* C; q$ q: Q! b. C用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
" l. M/ c8 D8 c以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

( P% f% F8 g0 k. O& y! M/ l

1 Y' z! X# h3 D- Z8 t回复 老姜 的帖子
9 Q  ^' J6 @$ j) I3 s
  G: J( ]5 i0 V2 A0 {4 y+ X% o& M' J/ a) J& M3 W( P
这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
& b. k1 O% `, k& s: }1 q需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。
( o; \. Q3 P' c, E  t* b; J离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。% c$ L8 p) D8 @* s- P- l+ Q- r6 V% K
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 ! K1 p* L% x1 s1 ]& s/ L5 G
回复 老姜 的帖子

: ]& h9 z3 X( m你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
- B. G) [/ [7 B9 O2 c4 R先剪成条儿，再剪成小块儿7 c+ C1 g% F! Z9 m* b
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起  W- D6 M5 n  v
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子! l3 n0 @% _3 M0 J9 W/ P2 ^

( w: d" Z( R+ q3 D8 x1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。
9 f( b1 f$ l% M( X' S- G2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。
/ r. U4 J* l* Q4 P9 Z1 K3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）4 _6 C5 m8 D% V; p8 Q# t! T' I
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
' L/ c1 ?) {2 ?! U: `供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子! Q0 o( a4 k" v, ^

& I+ B. K! |1 x$ ^需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

; @7 a/ X- _- y" B- T
- R4 y0 c2 W# ^! H回复 dongxin 的帖子7 r6 j* h! {# P

5 ~$ q7 T1 _& Q/ {( T% d" l谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！