脐带组织块贴壁法求助

老姜

回复 湖南干细胞 的帖子$ r9 B0 ]/ b! [5 }5 r

3 ^/ j: {: f/ F; D7 `  z你不妨将组织块用PBS洗涤后，直接加在新的干皿上（实质组织块还是湿润的），量要少于你第一张照片上的量，放入培养箱中3h后，轻轻加入8ml生长液，直接放入培养箱内，4-5天半量换液（这期间不要拿出来看呀，找相呀，太折腾了，它没法贴安身)以后三天半量换液，直到12或15天后，再根据细胞生长状况决定是否吸弃组织块。

湖南干细胞

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谢谢。1）脐带在半小时内开始操作，PBS冲洗3次后，剥离动静脉，撕出白色胶块（时间1-2小时）；2）剪碎（0.5-1小时）成0.5-3mm小块，倒入离心管，PBS 1000rmp，5min洗涤1次，添加1ml 培养液，组织块倒入到FBS包被的培养瓶中，9小时后添加培养液至没过组织块，此时已经有细胞爬出，并且很多组织块都漂浮 ，1天后大量细胞爬出，3天后半量换液，换液后细胞仍在，第5天细胞就基本上消失了，只有完全漂浮组织块及细胞碎片。没有每天动培养瓶，组织块就是贴壁不紧。

湖南干细胞

组织块贴壁法培养皿要铺多聚不？用玻璃的还是塑料的？1 h9 p4 q- D, R# i5 z0 k

湖南干细胞

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) I( K# a: M/ o; }' F  A% Z; u2 I% S$ h5 z5 G4 o
谢谢，换液前不敢动了。但是第一次组织块添加液体前就飘了好多。

spring1221

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第一次加液有组织块飘起来是正常的，建议加液时间再延后一点，倒置24小时后加液，贴壁时间太短，加液后就很容易让组织块浮动。组织贴壁法筛选的间充质细胞纯度比较高，也比较容易操作，有些文献报到动静脉跟表皮清除不干净都可以长出来，所以关键还是培养液的选择跟操作熟练度。祝你早日成功

老姜

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你用低面积多大的培养瓶养细胞，Ｔ２５总量只能加５ｍｌ液体，Ｔ７５加９ｍｌ还行，平底若铺了血清应该将血清晾干放组织块不漂的可能性才大，液体加多了，浮力大自然漂。培养瓶培养挑出组织块是不易操作的。培养细胞血清的浓度不是愈多愈好，最终不超过２０％为佳，因为体内废物的清除通过血液，血清中的含量也不能忽视。物极必反！

单个核细胞

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几条建议：
) A% V9 P) D- Z" j1.华通胶剪碎后不要洗涤，直接接种组织至培养瓶/皿。6 S3 A- E1 T: x" [
2.若是采用进口（康宁等）培养瓶/皿，不需要FBS包被。; e2 d: y. l8 [0 e0 Q/ |
3.贴壁3~5小时后补加培养液(下午接种的可以第二天加液，即贴壁过夜)，加液后的培养瓶/皿就不要经常动它了。: X  s) P. R) @& P( k8 s
4.第二天观察是否污染，8~10天后观察是否有细胞爬出。" q9 C" l6 Q0 b* M. v) g% d& [
5.细胞爬出后，可去掉旧培养液和组织块，换新培养液。
  u* G/ }0 L) s; k6.待贴壁细胞局部生长致密时，常规方法传代。

湖南干细胞

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! ^! k5 u2 Q' e; T* r谢谢，我确实发现以前没有洗涤的组织块贴壁牢些，我有一次细胞传代了，结果传代后细胞就一蹶不振了了，你也用0.25%的胰酶消化传代吗？我也看很多人用0.05%或0.125%胰酶消化，1:2传代？

湖南干细胞

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谢谢指点。

湖南干细胞

总结了一下各位前辈的回复，我想可能贴壁不牢主要在于，组织块刚接种时，组织块太湿；第一次添加液体时液体时枪头的冲力比较大，细胞容易在添加培养液时被冲下来。所以，打算改进这两点。