脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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7 q) L. F+ t5 q9 q; x; m) L将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
, t4 W: e' s9 s$ M剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。8 o7 g2 a4 c/ P
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
# _, f  q6 v7 `3 `; F5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
- T* o' J$ t* F% @5 ?5 x# @以上是我的组织块贴壁法，请教：
! A/ h: V+ l4 Z" T& P$ i①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？. P1 m1 \* d/ w0 W6 O( t4 ?* V
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?+ W1 b: [' t; H! {1 [4 E
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。) J; V; q6 L! H& M
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？* z2 e4 h' j; S# N; Z% e$ ]
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,+ N3 y# G0 N% R4 N5 K
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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回复 老姜 的帖子3 a( \# p" k3 J1 z! l0 _
- z6 M& P, x# {, r' {) k$ t( j

5 y& Y  C& w# o0 l; M" C这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
: I) S+ a- X( h* [  T4 T2 L需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。
! Z& K+ r. A! B) @' @9 e  T! h) m离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。0 Y- k( F% ]( B
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 * z2 h4 R3 I8 g6 |7 u
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你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
7 a0 D- _# [/ a先剪成条儿，再剪成小块儿% Z6 A4 ~) f9 g* _) l
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起
4 C6 ]) T# A* f) n  n2 d直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

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1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。
: \* F+ b8 a& P6 u7 O: o) ?2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。' d5 `  }' G/ N3 c5 j
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）
5 q+ E  y" n" P% N- p4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。3 \  T! Y% s  D7 B7 d+ w
供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子+ ]# b1 v$ j+ m7 Y8 M2 ~  D4 m3 x9 S
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需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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. g2 a" Z) M; `: v+ z8 d% J谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！