脐带组织块贴壁法求助

漂泊的风

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不需要的，直接底部贴壁即可，很容易爬出来的细胞，一般5天即可看到细胞

漂泊的风

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0 f! [2 C9 k* P- n8 E) ?2 x" I  J$ S/ U* M8 F) F% y$ z8 ~, O) _1 t
一般不需要的，除非脐血残留比较多，整个组织块是红色的，这时需要用PBS洗涤一次，否则不需要

湖南干细胞

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2 k8 a, s4 q$ s7 s) j" \+ g5 B5 ^/ R8 F  _
哦，谢谢。

spring1221

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) F2 ?7 J* {8 m- K6 p0 i4 T1 ]* A8 l$ L& k: o
第一次加液一定要从侧面贴壁慢慢加然后平放，不要直接冲过去。组织块铺的时候的湿度也确实需要注意，加油

湖南干细胞

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* W5 K& a3 j+ A
# H9 G& |" X: l5 y# u# O好的，谢谢。

单个核细胞

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' S( b& b' V/ I. _  d* x4 N: F传代用0.25%胰酶即可，T75瓶培养，1:3传代，也可以根据需要接种相应的细胞数，比如2×10^4 cells/cm^2，1×10^5 cells/ml 等等。

2013sp

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% \' L/ u& l. ?* P
  g9 S# w0 ~  \% R6 {( O前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。4 ^( e8 n1 N2 Z" R4 y6 N- I
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
: z$ _) _: }# d2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
: l4 N, \  E; O, N3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。: j8 g- f6 ~: H+ q! n
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
. G1 u3 u& l5 A4 S' E/ p. H5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。- [  Z; V2 d# l3 P# t
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。9 G" Z! y# G* F( p# m7 Y/ f3 s& `
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。7 u2 v4 w( C5 V+ l- _
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
3 v; y# Q* J6 w* M, i9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。# |( ]$ y. x( z% n4 W' @' f
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。' u* R" f4 M! T
11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次

2013sp

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1 {9 }8 o) `- V0 ~2 H8 F( Y5 t  B5 K9 p5 Q8 \: A1 w" a7 n
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
: W1 l: {5 ^' U# Q5 _$ n) X" a1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
) @, ~. M1 O2 Y" b) X  W- B# Z2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
) L. i! w1 t' H3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。/ F/ @! r9 }8 V- ]" ]
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。2 F* k; G/ e6 R* t  U' {2 s/ z
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。+ b- ?6 d- Z* r9 W9 j# w
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。- q% |$ q, |9 q4 D# {
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
# ]/ E1 L, u  {) N, d7 G# t# z8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
( D9 ^5 U5 _4 T, t9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。# k; l  ]* H/ Y) H  B/ ?% e2 m
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。) ~+ b. k: e% O, d3 {
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
% {0 _4 Y( D# o* u: w2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        7 n$ v: u- v$ ?! S7 j; T/ l
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。: m# y) g1 a' o) y, Y
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
  w+ \( ~0 n( d3 R) r$ X4 O5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。2 r8 i* H( r4 R( m; g0 L9 U- x
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。# }  g, S' J+ O
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。  o. ?* ~& V7 \2 w" M. P
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）1 O# m9 |) a% c7 Q3 d& e
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。0 [' w" N( K, q! O3 \8 G) v; }& M
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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$ |$ K! m; z; Q2 z! P7 r前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。7 {5 C/ R/ v' ?
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。4 u6 K6 W% |4 u" s
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        $ A! ]) ?, B0 w$ |
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。) X0 N! a3 M" ~% r  i* |( `
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
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' G8 K$ L! J. b- D4 F) F3 A8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
/ B" M) ~+ ?3 Z! _7 A9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
+ j% V, j7 W; R/ b6 e- e10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。