脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。% s0 e, O$ }6 w
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。
/ g7 w- J# P8 {  n8 j, B; W. ]$ }4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
' t, q6 s' }# V0 @& m: p& d5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
. M* F1 y9 t6 [6 A以上是我的组织块贴壁法，请教：
8 p9 t. M, d2 Z' \0 l' D①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？, X8 K8 X2 S( P4 O
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?3 |& M9 @! m( S" x: |. x
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。' T4 E& S4 W2 O. r& A
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？* z  T; v. D4 \& t: W7 |/ t
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min," J  ~. ]0 h% _) U0 y
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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/ }" s! U8 C/ p, x这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。% p( r; K& l/ g* \7 l3 c7 R* d) s
需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。+ R; l9 b3 p8 p' @( I: f
离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。0 J* L, O# Z5 m5 j' b0 q1 p5 Y9 I
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 8 P) i; v' {$ f# u4 N
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你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
" i) g4 X5 R1 Y- K! d& l: b/ P0 _先剪成条儿，再剪成小块儿
% O: {5 e' ]7 \* F8 l- u要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起7 q) F6 U0 i4 j3 V, N( J; q
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

回复 湖南干细胞 的帖子% u, |2 W4 f5 O
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1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。1 {2 K* o1 ?$ H: B3 f! ]
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。* j. U" B; a0 K( J+ w" H! U. T
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）. X% W$ B( j& X9 C8 w' [
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
$ `( Q* a- s# o- H0 g, ~4 i' n- Z供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子  x. K: t' l5 C3 O, O1 P/ r% A  f
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需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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回复 dongxin 的帖子# |- K: G" q) E5 C; U8 y0 w+ d

! }: H: n- I/ o* S) G谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！