如何形成拟胚体EB

小ga

请教各位战友，hES和iPS如何形成拟胚体EB ?EB形成后，主要想往神经干方向分化，如果采用悬浮培养，EB培养液应该如何配制？看了好多文献，EB培养液也各有不同，不知如何选择，请各位赐教！灰常感谢！

细胞海洋

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细胞海洋

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xieyuhuan

大家好，我想问下我用拟胚体悬滴法做的造血分化，做的过程中遇到很多问题，希望各位大叔呢个能传授下经验。% p! G  s4 k8 c' U# L: ]
我把人IPS消化成单个细胞后用培养基重悬25ul一滴悬滴置于10cm皿盖上，皿底放PBS，放置四天，后把形成的球吸取下来置于低吸附皿里，这过程中有时候球会散，养着养着就散掉了是怎么回事呢？还有形成的球继续往后做，14天后把EB消化成单个细胞，我用的是TRY在水浴箱消化30分钟，后取出再用10ml针头重悬吹打，可是细胞依旧还是团块，不能形成单个细胞，请问大神们这该怎么办，有什么办法能把细胞消化成单个细胞，又能尽量减少对细胞的损害呢？

wwy551

回复 echoxy1020 的帖子  J* z: B% b  z& t6 I
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我以前做过用人的ES细胞通过形成EB再向造血细胞分化。感觉形成EB挺简单的，当时的做法就是用dispase把ES消化下来，消化时间久一点，可以把克隆拍打下来或者用1ml移液管刮下来，收集到离心管中静置，待克隆沉降后，吸去上面的液体（包含很碎小的ES克隆和MEF），用DMEM/F12重悬，再静置吸去上层液体。最后用ES的培养基重悬，接种到低贴附培养板里。培养两天，然后换成分化培养基诱导分化。

echoxy1020

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我最近在做用人ips细胞形成EB，方法是用EDTA消化掉滋养层细胞，然后收集ips细胞制成悬液，加到96孔板离心，原则上应该24小时后就可以形成EB了，但不知道为什么总是不成功，不知道您有无相关经验，请赐教，谢谢！
: N& H' {0 f3 Z$ a/ }然后我查了下其他方法，悬滴法是否适合人ips细胞？如果可以，悬滴的培养液用什么？形成后悬浮培养用的培养液要更换吗？待到EB接种到matrigel后再换分化液？5 z0 L/ @- e; [8 M
悬浮法看起来好像更简单一些，而且也许因为没有成单细胞是不是成功率会更大一些？但是如何控制EB大小？我看你说第二天可以换分化液，那什么时候种EB呢？6 z5 \$ Q) O' S4 v
不好意思问题比较多，做了好久都不行，实在是焦灼😂😂😂

wwy551

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5 t& |, m% f4 n5 `, H+ r) r* G" c$ f# `8 l' S) A
human embryonic stem cell medium 人胚胎干细胞培养基

echoxy1020

回复 wwy551 的帖子6 A6 Z$ I2 R! |: E: ?& W
2 F" Y' ]5 }$ l6 K: s
您好，弱弱地问一下HESM是什么？您是指悬浮的克隆碎片会自然生成EB吗？

ligangtiancai

我们实验室是用IV型胶原酶将iPSC克隆消化下来后吹成小团块做EB的，效果不错

小ga

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' _& [8 n+ K# i( G5 S( C7 k是用0.05%的胰酶吗？可不可以用Accutase呢？